De experimenten die methyleenblauw met celademhaling in verband brachten

Gedefibrineerd menselijk bloed dat drie uur lang op 37 °C wordt gehouden, verbruikt ongeveer twee procent van de zuurstof die het bevat. Voeg vóór de incubatie een kleine hoeveelheid methyleenblauw toe, en hetzelfde bloed verbruikt ongeveer vijfenzestig procent. Aan de cellen veranderde niets. Alleen aan de oplossing.

Dat getal komt uit een artikel uit 1928 van George Harrop en E. S. Guzman Barron aan Johns Hopkins, en vormt de oorsprong van de veelgehoorde uitspraak dat methyleenblauw de celademhaling verbetert. Die uitspraak is niet onjuist, maar heeft een beperktere betekenis dan ze lijkt te hebben.

Wat het getal in de tabel daadwerkelijk meet

Het eindpunt was zuurstofopname, bepaald met gasanalyse. Harrop en Barron filterden vers afgenomen bloed bij 10 °C door watten om de witte bloedcellen te verwijderen, verzadigden het monster met zuurstof, verdeelden het, voegden aan één deel kleurstof toe en analyseerden beide delen na incubatie. Het aantal leukocyten kwam zelden boven ongeveer duizend per kubieke millimeter. Het zuurstofverbruik werd gerapporteerd als het aandeel van de aanvankelijke zuurstofinhoud van het monster dat was verdwenen.

Ze maten ook koolstofdioxide, en daar werkte de methode tegen. Gedefibrineerd bloed gaf in het eerste uur van de incubatie tot twee millimol koolstofdioxide per 100 mL af om redenen die niets te maken hadden met de onderzochte reactie. Daardoor waren respiratoire quotiënten uit volbloed onbruikbaar. Alleen gewassen cellen in Locke-oplossing leverden interpreteerbare waarden op, die met en zonder de kleurstof tussen 0.73 en 0.80 lagen.

Dat detail is geen bijzaak. ‘Ademhaling’ betekent in deze artikelen gasuitwisseling in een afgesloten vat. Het verschil tussen zuurstofverbruik en bruikbare energieopbrengst wordt afzonderlijk besproken in wat zuurstofverbruik je wel en niet vertelt over ATP.

De kleurstof voegde het meest toe waar de cellen het minst ademhaalden

Rijpe erytrocyten van zoogdieren hebben vrijwel geen meetbaar zuurstofverbruik. Kernhoudende erytrocyten van vogels wel. Harrop en Barron onderzochten beide, en dit contrast vormt de kern van hun betoog.

In de zoogdiermonsters veroorzaakte de kleurstof een twintig- tot vijftigvoudige toename. In ganzenbloed, waarvan de cellen al ademhaalden, werd de snelheid nooit meer dan verdubbeld. Hoe hoger de aanvankelijke ademhaling, hoe minder de kleurstof kon toevoegen.

Dezelfde gradiënt is binnen één soort zichtbaar. Een menselijk monster van een patiënt met polycythaemia vera, dat onrijpe cellen bevatte, verbruikte zonder kleurstof 11.3 procent van zijn zuurstof, tegenover 2.8 procent voor gewassen cellen van een gezonde donor. Met kleurstof steeg dit slechts tot 63.4 procent: een zesvoudige versnelling, terwijl normale cellen bijna dertigvoudig versnelden. De kleurstof liet rijpe cellen zich meer als onrijpe cellen gedragen, precies wat de auteurs zeiden dat ze deed.

Cyanide had het moeten stoppen

Het was bekend dat cyanide cellulaire oxidatie stopte. Harrop en Barron voegden het toch toe, samen met de kleurstof.

De resultaten met runderbloed zijn representatief. Zonder toevoegingen daalde het zuurstofgehalte in drie uur van 22.61 naar 22.03 volumeprocent. Met methyleenblauw daalde het tot 12.84. Met methyleenblauw en kaliumcyanide in een concentratie van één vijfduizendste molair daalde het tot 12.74. Het effect van de kleurstof bleef vrijwel onaangetast.

Figuur: een doorlopende microrespirometrische registratie van menselijke erytrocyten. De pijl markeert de toevoeging van methyleenblauw. Daarvóór is de curve vrijwel vlak; daarna stijgt ze gestaag. Overgenomen uit Harrop en Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Hun conclusie was dat de kleurstof als zuurstofdrager werkte en ‘een stof aanlevert die uit rijpe, kernloze erytrocyten van zoogdieren is verdwenen’. Twee jaar later formuleerden Michaelis en Salomon van het Rockefeller Institute het meningsverschil in de vorm die het zou behouden. Ofwel was het effect van de kleurstof ‘een toevallige eigenschap van de kleurstof’, ofwel was de kleurstof ‘een model voor een onbekende stof in de organismen’. Die twee mogelijkheden zijn nog steeds niet definitief beslecht. Wat wel veranderd is, is dat de cellen nu veel nauwkeuriger kunnen worden beschreven.

Een leverextract deed hetzelfde

Michaelis en Salomon toonden aan dat extracten van organen, bereid met koud water, dezelfde stimulatie veroorzaken. Rattenlever gaf het sterkste effect, gevolgd door nier, milt en testikel. Hersenen, spieren en bloedserum hadden weinig of geen effect.

Vervolgens testten ze het extract met koolstofmonoxide. Ademhaling opgewekt door het extract of de kleurstof bleef onveranderd in een mengsel van 98 procent koolstofmonoxide en 2 procent zuurstof. Hetzelfde gasmengsel remde de ademhaling van gist en van kernhoudende erytrocyten van hoenders met ongeveer 60 tot 80 procent, in overeenstemming met Warburgs beschrijving van een voor koolstofmonoxide gevoelig ademhalingsferment. De ongeïdentificeerde stof uit het weefsel was dus niet het enzym van Warburg.

Onderweg vielen verschillende mogelijke kandidaten af. Gereduceerd glutathion en cysteïne veroorzaakten alleen het zuurstofverbruik dat voor hun eigen oxidatie nodig was. Het co-enzym van Harden en Young werd uitgesloten omdat spierweefsel er het meeste van bevat en vrijwel het geringste effect vertoonde. Keilins cytochroom, dat enkele jaren eerder die naam had gekregen, liep tegen dezelfde tegenstrijdigheid aan. Hun eigen voorstel, dat de actieve stof uit de celkern afkomstig was, noemden ze niet meer dan een suggestie.

Aan het effect waren voorwaarden verbonden

De cellen moesten intact zijn. Hemolyse door gedestilleerd water of herhaaldelijk bevriezen maakte een einde aan de reactie op zowel de kleurstof als het extract, en gedeeltelijke hemolyse verminderde die reactie naar verhouding.

Ook suiker was nodig. Glucose, fructose en sacharose ondersteunden de door de kleurstof opgewekte ademhaling; mannitol niet. Zonder suiker was er helemaal geen ademhaling, en de kleurstof leek daarbij de cellen te beschadigen. Glucose die één of twee uur later werd toegevoegd, herstelde de ademhaling daarom niet. De auteurs suggereerden dat de kleurstof een structurele component oxideerde die de cel nodig had.

Belichting versterkte het effect van de kleurstof aanzienlijk, hoewel het effect ook in het donker duidelijk was. Andere reduceerbare kleurstoffen gedroegen zich anders: toluyleenblauw evenaarde of overtrof methyleenblauw, terwijl indigodisulfonaat vrijwel niets deed. Er kwam geen eenduidig verband naar voren tussen de oxidatie-reductiepotentiaal van een kleurstof en de omvang van het effect. De auteurs schreven dit toe aan membraanpermeabiliteit en toxiciteit.

Het effect volgde de fermentatie, niet de ademhaling

In zijn onderzoek uit 1930 stapte Barron over van celsuspensies op weefselplakjes van normale rattenorganen en getransplanteerde tumoren.

In weefsels zonder aerobe glycolyse deed methyleenblauw niets of remde het het zuurstofverbruik licht: in de nier met ongeveer 14 procent, in de alvleesklier met ongeveer 14 procent en in de lever met ongeveer 5 procent. In weefsels die in aanwezigheid van zuurstof fermenteren, verhoogde het het verbruik: in de milt met ongeveer 8 procent en in de hersenen met ongeveer 13 procent. De toenamen bij tumoren liepen uiteen van ongeveer 27 procent in een menselijk borstcarcinoom tot meer dan 80 procent in een Rous-sarcoom bij een kip, ruwweg evenredig met de aerobe glycolyse van elk weefsel.

Figuur: elk punt staat voor één weefseltype. De horizontale as geeft de aerobe glycolyse weer; de verticale as de verandering in zuurstofverbruik na methyleenblauw. Gegevens uit Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), tabel 6, PMID 19869777.

Het cyanide-experiment leverde vervolgens het spiegelbeeld op. Toen de ademhaling in die eerder niet-reagerende weefsels met cyanide werd geblokkeerd en de fermentatie naar voren kwam, verhoogde de kleurstof het zuurstofverbruik opnieuw: in de nier met ongeveer 59 procent, in de lever met ongeveer 19 procent, in de milt met ongeveer 286 procent en in de testikel met ongeveer 200 procent.

Barron stelde voor dat de kleurstof kon dienen als test voor het fermentatieve vermogen van een cel of weefsel, en sloot af met een speculatie: generaties tumorcellen kweken in een medium met kleurstof zou de stofwisseling van een tumor ooit blijvend kunnen laten lijken op die van normaal weefsel. Dat was een onderzoeksvraag die in 1930 werd opgeschreven. Het is geen claim over een behandeling.

Wat de experimenten niet gemeten kunnen hebben

In 1928 en 1930 betekende ‘ademhaling’ zuurstofverbruik. Adenosinetrifosfaat werd voor het eerst beschreven in 1929, en pas in 1949 werd aangetoond dat geïsoleerde mitochondriën fosfaat veresteren terwijl ze elektronen overdragen. Geen van de vroege artikelen over methyleenblauw kon energieproductie hebben gemeten, en geen ervan beweerde dat te hebben gedaan.

De cellen vormen het tweede probleem. Rijpe erytrocyten van zoogdieren bevatten geen mitochondriën. Tijdens het reticulocytenstadium verwijderen ze mitochondriën en ribosomen door selectieve autofagie. Daarom draait een rijpe rode bloedcel op glycolyse en is die voor NADPH, meer dan voor ATP, afhankelijk van de pentosefosfaatroute. In de experimenten uit 1928 was er geen elektronentransportketen aanwezig om te herstellen. Wat de zuurstof ook verbruikte, het deed iets anders.

Wat dat andere proces was, is inmiddels redelijk goed beschreven. Methyleenblauw neemt elektronen op van cellulaire reducerende equivalenten en wordt leucomethyleenblauw. Dit wordt door moleculaire zuurstof opnieuw geoxideerd, waarmee de cyclus wordt gesloten. In menselijke rode bloedcellen voeren NADPH-afhankelijke flavinereductase en verwante disulfidereductasen de reductiestap uit. Een onderzoek uit 1976 met gelabelde glucose wees uit dat de kleurstof de hexosemonofosfaatshunt stimuleert, dat het effect bij lage concentraties afhankelijk was van oxyhemoglobine en dat een hogere concentratie, 0.1 mM, waterstofperoxide genereerde. Een gereduceerde kleurstof die met zuurstof in contact komt, produceert peroxide, geen fosfaatbindingen.

In mitochondriën is het beeld meer omstreden dan populaire samenvattingen doen vermoeden. Eén onderzoekslijn stelt dat de kleurstof elektronen uit de omgeving van complex I opneemt en ze aan cytochroom c doorgeeft. Een andere stelde vast dat de kleurstof in mitochondriën uit muizenhersenen de ademhaling na een blokkade met antimycine niet kan herstellen, en plaatste de elektronenacceptor in plaats daarvan op de ubiquinolbindingsplaats van complex III. Een derde vond dat lage concentraties het zuurstofverbruik in rust verhoogden, terwijl de door ADP gestimuleerde ademhaling onveranderd bleef. De meest directe formulering van dit punt is dat door methyleenblauw opgewekt zuurstofverbruik helemaal niet afhankelijk is van oxidatieve fosforylering: het bleef bestaan wanneer de ademhalingsketen werd geremd, en in preparaten zonder zo'n keten.

Er bestaan ook directe metingen van de kloof tussen beide grootheden. In geïsoleerde mitochondriën uit rattenlever verlaagden toenemende kleurstofconcentraties de respiratoire controleratio's en veroorzaakten ze zwelling, wat de auteurs omschreven als ontkoppeling van de oxidatieve fosforylering. In geperfundeerde rattenlever verhoogde methyleenblauw het zuurstofverbruik terwijl de ATP/ADP-verhouding daalde.

De klinische literatuur draagt dezelfde boodschap uit. Methemoglobinemie wordt behandeld met ongeveer één tot twee milligram methyleenblauw per kilogram, intraveneus toegediend, via een NADPH-afhankelijke reductieroute, en hogere doses veroorzaken juist de aandoening die wordt behandeld. Hetzelfde overzicht vermeldt dat het effect als antidotum het grootst is in intacte erytrocyten en afneemt bij hemolyse. Daarmee duikt de bevinding over hemolyse uit 1930 drieënzeventig jaar later opnieuw op in een ziekenhuiscontext. Bij een verbinding waarvan de nuttige en schadelijke effecten aan weerszijden van een dosisdrempel liggen, hoort de dosis niet uit een zuurstofverbruiksmeting te worden afgeleid.

Waarom de batch in de discussie thuishoort

Harrop en Barron merkten iets op dat een tweede lezing waard is. Methyleenblauw zelf geeft in de spectroscoop een band tussen de twee kenmerkende banden van methemoglobine, ‘wat bij oppervlakkige inspectie gemakkelijk tot verwarring kan leiden’. De kleurstof kan de stof waarnaar wordt gezocht nabootsen.

Hetzelfde probleem heeft een chemische vorm. Een verwante fenothiazine die als nevenbestanddeel aanwezig is, heeft zijn eigen redoxgedrag, zijn eigen permeabiliteit en zijn eigen toxiciteit. Eén gedocumenteerd geval maakt duidelijk wat er op het spel staat: in een onderzoek naar de jodering van methyleenblauw produceerden monsters die ongeveer 7 tot 8 procent Azure B bevatten voornamelijk gejodeerd Azure B. Daardoor bepaalde de onzuiverheid, en niet het methyleenblauw, het verloop van de reactie.

Wie methyleenblauw als reagens gebruikt, in een laboratorium, bij het kleuren van preparaten of in een aquarium, werkt met een niet nader omschreven ingrediënt zolang de batch niet is gekarakteriseerd. Verwante stoffen, identiteit, elementaire onzuiverheden, restoplosmiddelen en gloeirest maken deel uit van het experiment; het is geen papierwerk eromheen. Blupreme betrekt zijn methyleenblauw van een farmaceutische fabrikant en publiceert een volledig analysecertificaat, waarbij de volledige USP-specificatie wordt getest en niet alleen zware metalen. De handleiding voor het lezen van een analysecertificaat en wat de aanduiding USP-kwaliteit wel en niet aantoont behandelen hoe je het document aan de claim kunt toetsen.

Het getal klopte

De experimenten uit 1928 en 1930 waren zorgvuldig, en hun centrale waarneming heeft standgehouden: een reduceerbare kleurstof kan een cel die nauwelijks ademhaalt vele malen meer zuurstof laten verbruiken dan in rust, zonder de stap te doorlopen die cyanide blokkeert.

De fout ontstaat later, wanneer ‘ademhaling’ in zijn moderne betekenis wordt gelezen. Een gasuitwisselingsmeting vertelt je dat elektronen bij zuurstof zijn aangekomen. Ze vertelt je niet dat ook maar één daarvan is gebruikt om ATP te maken, en in een cel zonder mitochondriën is de afstand tussen die twee uitspraken zo groot als maar mogelijk is. Het bredere overzicht van wat methyleenblauw in cellen doet plaatst hetzelfde onderscheid in een ruimer kader, en de geschiedenis van de verbinding, van kleurstof tot geneesmiddel legt uit hoe een textielkleurstof überhaupt bij deze experimenten terechtkwam.