Hoe methyleenblauw werkt: elektronenoverdracht en waar de elektronen terechtkomen

Een afgesloten kolf op een werkbank is de kortste eerlijke introductie tot hoe methyleenblauw werkt. Water, glucose, een snufje natriumhydroxide en genoeg kleurstof om de vloeistof diep, onmiskenbaar blauw te maken. Wacht een paar minuten en het blauw verdwijnt totdat de kolf eruitziet alsof hij water bevat. Schud ermee en de kleur komt meteen terug. Daarna vervaagt hij opnieuw, en dat blijft gebeuren zolang er glucose is die elektronen wil afstaan en zuurstof die ze wil opnemen.

Aan de kleurstof is niets veranderd behalve het aantal elektronen dat ze draagt. In geoxideerde vorm is ze blauw. In gereduceerde vorm niet. Vrijwel al het andere in de therapeutische en onderzoeksliteratuur over dit molecuul volgt uit die ene omkeerbare stap, omdat een molecuul dat elektronen van de ene partner kan opnemen en aan een andere kan doorgeven een relais is, en een relais op zichzelf niets doet. Wat het doet, hangt volledig af van wat zich aan beide uiteinden ervan bevindt.

Twee vormen, en waarom het paar ertoe doet

De geoxideerde vorm is een vlak, positief geladen ringsysteem. Die vlakke, geladen vorm verklaart waarom het zich opstapelt tegen nucleïnezuren, waarom het bindt aan gesialyleerde structuren op celmembranen en waarom het zichtbaar licht sterk absorbeert tussen ongeveer 600 en 700 nanometres, het deel van het spectrum dat het menselijk oog als blauw waarneemt.

De gereduceerde vorm is iets heel anders. Ze draagt geen lading, lost op in vet in plaats van water en is kleurloos. De ionisatie ervan is bij de pH in het lichaam zeer laag, in de orde van enkele per cent. Daardoor passeert het gereduceerde molecuul gemakkelijk een celmembraan via diffusie, en eenmaal binnen, waar de omgeving meer oxiderend is, kan het opnieuw worden geoxideerd en effectief worden vastgehouden. Het geoxideerde ringsysteem is vlak; het gereduceerde kan verdraaien. Die structurele gevolgen, en de kleurverandering zelf, horen bij het verhaal van de twee vormen en worden uitgebreider behandeld in de vergelijking van methyleenblauw en leucomethyleenblauw.

Elektronen opnemen

De geoxideerde kleurstof kan elektronen opnemen van een groot aantal donoren. Glucose in de demonstratiekolf is daar één van. In een cel zijn gereduceerde pyridinenucleotiden en componenten van de mitochondriale elektronentransportketen andere voorbeelden. Wanneer methyleenblauw wordt gereduceerd in weefsel dat zuurstof bevat, verbruikt de cyclus die daardoor ontstaat zowel het reducerende middel als zuurstof en produceert hij reactieve zuurstofsoorten, voornamelijk waterstofperoxide. De kleurstof komt onveranderd uit de cyclus en is klaar om die opnieuw te doorlopen.

Dat laatste punt verklaart een tegenstelling die anders slordig lijkt. Methyleenblauw wordt in de literatuur zowel als pro-oxidant als antioxidant beschreven, en beide beschrijvingen zijn verdedigbaar. Het kan de productie van superoxide onderdrukken door als kunstmatige elektronenacceptor te fungeren en de elektronenstroom weg te leiden van de enzymplaatsen waar zuurstof anders zou worden omgezet in superoxideradicalen. In levercelculturen is aangetoond dat het fase-2-antioxidatieve afweerenzymen induceert, waaronder thioredoxinereductase 1 en NADPH-chinonoxidoreductase. Welke van de twee kanten zichtbaar wordt, hangt af van welk uiteinde van het relais op dat moment een tekort aan elektronen heeft. Een vraag als "is methyleenblauw een antioxidant" is pas goed geformuleerd wanneer duidelijk is in welk systeem, bij welke concentratie en met welke andere aanwezige stoffen.

Elektronen doorgeven

Zodra de kleurstof een extra elektron draagt, kunnen er vervolgens drie heel verschillende dingen gebeuren, die meestal onder één noemer worden geplaatst. Dat zouden ze niet moeten worden.

Het kan het elektron doorgeven aan een metaalcentrum. Het duidelijkste geval is hemoglobine dat van de ferro- naar de ferritoestand is geoxideerd. In die toestand kan het geen zuurstof vervoeren. In rode bloedcellen reduceert een enzym de kleurstof, waarna de gereduceerde kleurstof niet-enzymatisch elektronen overdraagt aan het geoxideerde haemijzer, waardoor functionerend hemoglobine wordt hersteld en de kleurstof terugkeert naar haar geoxideerde vorm. De kleurstof wordt hierbij niet verbruikt; ze doorloopt een cyclus. Het klinische beeld dat op deze reactie berust, behoort tot de ziekenhuisgeneeskunde, en de uitleg over methyleenblauw bij methemoglobinemie behandelt hoe het wordt gebruikt en waarom het zo nauwlettend wordt gecontroleerd.

Een eerlijke kanttekening bij de bronnen: de twee overzichtsartikelen waarop dit artikel is gebaseerd noemen niet dezelfde reducerende cofactor voor de enzymatische stap; het ene noemt NADH en het andere NADPH. Dat verschil is reëel en blijft in de hier beschikbare bronnen onopgelost. Daarom is het veiliger om de rol van elk onderdeel te beschrijven dan één specifieke cofactor te noemen.

Het kan energie, of een elektron, overdragen aan zuurstof als er licht aanwezig is. Deze route bestaat alleen onder belichting. De aangeslagen kleurstof bereikt een triplettoestand, van waaruit twee mechanismen mogelijk zijn. In het eerste reageert de aangeslagen kleurstof rechtstreeks met een naburig molecuul door een waterstofatoom op te nemen of een elektron over te dragen, waardoor radicalen ontstaan; een dergelijke reactie met water produceert hydroxylradicalen. In het tweede wordt de excitatie-energie overgedragen aan zuurstof zelf, waardoor singletzuurstof ontstaat, een sterk elektrofiele soort die binnen microseconden vervalt en algemeen wordt beschouwd als de belangrijkste route waarlangs belicht methyleenblauw microbiële cellen beschadigt. Reacties met lipiden en peptiden in de celomhulling en met guaninebasen in DNA behoren tot de gedocumenteerde uitkomsten.

Het praktische gevolg van deze route is dat belichting de waarden met ordes van grootte verandert. In de gegevens verzameld door Wainwright en Crossley heeft methyleenblauw tegen Pseudomonas aeruginosa een minimale bactericide concentratie van ongeveer 500 micromolar in het donker en ongeveer 25 micromolar bij een lichtdosis van 12 joules per square centimetre. Tegen één stam van Staphylococcus aureus zijn de waarden in het donker en onder belichting beide 5 micromolar. Met andere woorden: of het molecuul überhaupt als antimicrobieel geldt, is geen eigenschap van alleen het molecuul; het is een eigenschap van het molecuul plus het licht.

Het kan rechtstreeks op een enzymplaats werken, zonder het relais. Methyleenblauw oxideert het ferro-ijzer dat aan stikstofoxidesynthase is gebonden, waardoor het enzym wordt uitgeschakeld. Het blokkeert oplosbare guanylaatcyclase, en tussen 1 en 10 micromolar is de gebruikelijke laboratoriumconcentratie die daarvoor wordt toegepast. Het remt monoamineoxidase type A met een IC50 tussen 27 en 180 nanomolar, het mechanisme achter de goed gedocumenteerde interactie met serotonineheropnameremmers en de reden waarom geneesmiddelinteracties van methyleenblauw een categorie op zichzelf vormen.

Deze drie routes zijn chemisch verschillend. Ze samenvoegen tot één algemene bewering dat methyleenblauw via redoxcycli werkt, is de belangrijkste reden waarom zoveel teksten erover tegelijk stellig en vaag overkomen.

Vier onderscheidingen die bepalen of een uitspraak over een mechanisme iets betekent

Welke vorm. De gereduceerde kleurstof is niet uitwisselbaar met de geoxideerde kleurstof. Remming van acetylcholinesterase illustreert de valkuil: tijdens een lange in-vitro-incubatie wordt methyleenblauw geleidelijk gereduceerd tot zijn kleurloze vorm en neemt de remming af, omdat het gereduceerde molecuul dat enzym niet remt. Een test die lang genoeg duurt om de vorm te veranderen, zal een zwakker effect rapporteren en een verkeerde verklaring in de hand werken.

Welke concentratie. Het laboratoriumbereik voor remming van oplosbare guanylaatcyclase is 1 tot 10 micromolar. Voor het volledig onderdrukken van glutamaatgemedieerde transmissie in hippocampuscoupes van ratten was 5 tot 50 micromolar nodig. Toxische effecten in celcultuur worden gerapporteerd boven 100 micromolar. Dit zijn niet dezelfde experimenten, en een mechanisme dat bij 50 micromolar is bevestigd, is niet automatisch van toepassing op een patiënt bij wie de plasmaconcentratie slechts een fractie daarvan bedraagt.

Welke route. De absolute orale biologische beschikbaarheid is ongeveer 72 per cent en de terminale plasmahalfwaardetijd is 5 tot 7 hours. Orale toediening leidt tot hogere concentraties in de darm en lever; intraveneuze toediening leidt tot hogere concentraties in de hersenen. De route bepaalt welk weefsel met de elektronen in aanraking komt.

Welk model, en of het licht aan was. Een groot deel van de mechanistische literatuur bestaat uit onderzoek in celculturen en knaagdieren, en in-vitroresultaten met dit molecuul hangen af van blootstelling aan licht, membraanpotentiaal en de redoxtoestand van de cellen, omdat een microscooplamp al voldoende is om het te fotosensibiliseren. Tussen 65 en 85 per cent van een toegediende dosis wordt in rode bloedcellen en perifeer weefsel gereduceerd tot de kleurloze vorm. Elk van deze variabelen bevindt zich tussen een duidelijk mechanisme in een schaaltje en een bewering over een mens.

Waarom de zuiverheidsvraag een chemische vraag is

Belichting demethyleert methyleenblauw. Het eerste product is Azure B, daarna Azure A en vervolgens thionine, en een hogere lichtintensiteit veroorzaakt meer afbraak dan een lagere. Een molecuul waarvan het nut berust op het vermogen om elektronen op te nemen en af te staan, is dus een molecuul waarvan de waarschijnlijke afbraakproducten nauw verwante chemische verbindingen zijn die in dezelfde oplossing blijven. De samenstelling van wat zich in de verpakking bevindt, is geen cosmetisch detail.

Daarom is conformiteit met de USP-specificatie de relevante test voor een koper. Een product dat daar niet aan voldoet, is een kleurstof, en een kleurstof bevat onzuiverheden, waaronder Azure B, zware metalen en residuele oplosmiddelen, die iemand die het inslikt niet wil binnenkrijgen. Een extra valkuil is een verkoper die uitsluitend op zware metalen test en het resultaat presenteert als volledige naleving. Blupreme werkt samen met een farmaceutische fabrikant van methyleenblauw en test de volledige specificatie: identiteit, zuiverheid, organische onzuiverheden, residuele oplosmiddelen, elementaire onzuiverheden, gloeirest, microbiële limieten en bacteriële endotoxinen. Het laboratoriumtestdocument bij elke batch wordt gepubliceerd, en een leverancier kiezen komt grotendeels neer op controleren of dat document bestaat en wat het omvat.

Eén omkeerbaar paar. Meerdere routes die eruit voortkomen. De route bepaalt welke bewering kan worden gedaan.