De geschiedenis van methyleenblauw: van kleurstof tot geneesmiddel en onderzoek

Methyleenblauw bereikte een patiënt voordat het een apotheek bereikte.

Het verslag uit 1891 van Paul Guttmann en Paul Ehrlich over het gebruik van de kleurstof bij malaria bevat twee temperatuurgrafieken. De tweede loopt van 13 juli tot 5 augustus, waarbij de behandeling dag voor dag langs de rand is genoteerd. Bij 18 en 19 juli staat "1 × 0,05 Methylenblau". Voor de daaropvolgende dagen worden vijf en zeven doses van dezelfde hoeveelheid vermeld, en op 22 juli is een kleine hoeveelheid kinine aan het overzicht toegevoegd. De koortslijn, die in de eerste helft van de grafiek tussen 37 °C en 39.5 °C schommelt, vlakt af nadat de kleurstof wordt toegediend en blijft gedurende de resterende drie weken tussen ongeveer 36 °C en 37.5 °C.

De patiënt was een van de twee, in het artikel beschreven als een huisbediende en een matroos. De stof die zij kregen was al vijftien jaar een commerciële textielkleurstof, en de twee mannen behoren tot de eerste mensen van wie is vastgelegd dat zij werden behandeld met een volledig synthetisch geneesmiddel dat op een specifiek organisme was gericht.

De kleurstof kwam eerst

De eerste commercieel succesvolle synthetische kleurstof werd in 1856 ontwikkeld door William Henry Perkin. Perkin was achttien, werkte tijdens de paasvakantie in een laboratorium aan huis en probeerde kinine te synthetiseren. In plaats daarvan verkreeg hij een zwart residu, loste het op en ontdekte een kleur die zich uitstekend aan zijde hechtte. Hij patenteerde de kleurstof in augustus 1856 en had tegen het einde van 1857 een fabriek die een Londense zijdeververij bevoorraadde.

In 1875 synthetiseerde Adolf von Baeyer een rode kleurstof en noemde die eosine, naar Eos, het Griekse woord voor de dageraad. In 1876 ontwikkelde Heinrich Caro, destijds directeur van het laboratorium van Badische Anilin- und Soda-Fabrik, samen met Baeyer methyleenblauw als een op aniline gebaseerde kleurstof voor katoen. De chemische structuur ervan werd pas ongeveer negen jaar later definitief vastgesteld.

Die oorsprong is nog steeds zichtbaar in de naam van de stof. "Methyleenblauw" is een handelsnaam uit de kleurstoffencatalogus, geen chemische beschrijving. De verbinding waarnaar de naam verwijst is methylthioniniumchloride, en de verschillen tussen de naam, het zout en de hydraten ervan worden relevant zodra iemand het materiaal afweegt of een specificatie leest.

Kleuring vormde de brug

De route van de ververij naar het ziekenhuis liep via de microscoop en begon al voordat methyleenblauw bestond. Wilhelm Erb was de eerste die een synthetische kleurstof op bloed toepaste, met picrinezuur in 1865, en zag in sommige rode bloedcellen een reticulair patroon.

Paul Ehrlich vergeleek in zijn proefschrift uit 1878 histologische kleuring met het verven van textiel en stelde dat beide chemische reacties waren. Terwijl hij onder Robert Koch aan de tuberkelbacil werkte, deelde hij anilinekleurstoffen in zure en basische klassen in en stelde hij vast dat elke klasse andere delen van een cel kleurde. In 1880 mengde hij de twee: een verzadigde oplossing van methyleenblauw werd in zure fuchsine gegoten totdat de bovenstaande vloeistof helder werd. Het resultaat, dat hij het neutralen Farbkörper of de neutrale kleuring noemde, leverde drie kleuren op in plaats van één, maakte korrels zichtbaar in de polymorfonucleaire cellen die eerder niet zichtbaar waren geweest en maakte de eerste differentiatie van leukocyten mogelijk. Omdat deze korrels beide bestanddelen van het mengsel opnamen, bedacht Ehrlich het woord neutrofiel voor de cellen die ze droegen.

Twee jaar later gebruikte Koch methyleenblauw om de tuberkelbacil te vinden, en in 1883 verbeterde Ehrlich de methode. In 1886 publiceerde hij een ander soort waarneming: hij injecteerde de kleurstof in levende dieren, vergeleek hoe sterk elk orgaan deze opnam en concludeerde dat de stof een duidelijke affiniteit had voor hersen- en zenuwweefsel. Hij schreef die affiniteit toe aan de oxidatie-reductiecyclus van de kleurstof, die hij het jaar ervoor had waargenomen. Die cyclus verklaart ook waarom een oplossing van methyleenblauw haar kleur verliest wanneer de zuurstof wordt verbruikt en die terugkrijgt wanneer er weer lucht bijkomt. De experimenten waarin de gevolgen van die cyclus voor het eerst werden gemeten behoren tot een later decennium, en het mechanisme zelf is een afzonderlijk onderwerp naast de geschiedenis.

De parasiet en de paarse kern

Alphonse Laveran ontdekte de malariaparasiet in 1880 door vers, ongekleurd bloed te onderzoeken. Om de parasiet routinematig in een gedroogd uitstrijkje te kunnen zien, was een kleuring nodig, en de kleurstoffen van die tijd leverden alleen rood en blauw op.

In 1888 verving de Poolse patholoog Czesław Cheçinski zure fuchsine door eosine, waardoor een mengsel van methyleenblauw en eosine ontstond. De casus waarop zijn methode was gebaseerd betrof een soldaat die op 30 september 1887 aan malaria was overleden. In de bloeduitstrijkjes zag Cheçinski blauwe, madeliefachtige vormen, die nu worden herkend als Plasmodium malariae, en sikkelvormige vormen, die nu worden herkend als de gametocyten van Plasmodium falciparum. Het resultaat maakte in één keer een einde aan twee concurrerende verklaringen van de ziekte: de miasmatheorie en de bewering van Edwin Klebs en Corrado Tommasi-Crudeli dat malaria door een bacterie werd veroorzaakt.

De parasiet was zichtbaar. De kern ervan niet, waardoor de aard ervan onduidelijk bleef. Ernst Malachowski, een arts in Breslau, loste dat probleem eerst bij toeval en daarna doelbewust op. In 1889 merkte hij in een preparaat een differentiële kleuring van de plasmodiumkern op, maar hij kon die niet reproduceren. Het aanzuren van het methyleenblauw hielp niet. Door het met borax alkalisch te maken, trad het effect iedere keer op. Hij demonstreerde de techniek publiekelijk op 15 juni 1890 en publiceerde haar datzelfde jaar, met een uitgebreidere methode in augustus 1891.

Dmitri Romanowsky publiceerde zijn eigen versie in september 1891. Zijn beste resultaten kwamen uit een verwaarloosde, beschimmelde fles met een oplossing van methyleenblauw die meer dan twee maanden oud was. Malachowski's beschrijving was doelbewust en, in zijn woorden, gemakkelijk reproduceerbaar; Romanowsky's methode was een doodlopende weg die één keer werkte. Toch ging het eponiem naar Romanowsky, en het geschil over wie het paars produceerde waarmee de kern zichtbaar werd is een afzonderlijk verhaal met zijn eigen documenten.

Figuur: de tweede temperatuurgrafiek uit het verslag van Guttmann en Ehrlich uit 1891. Het bovenste paneel beslaat 13 tot 24 juli en het onderste paneel 25 juli tot 5 augustus; de vermeldingen in de marge geven de toegediende doses aan, en de temperatuur blijft tijdens de laatste drie weken van het overzicht rond normaal. Overgenomen uit het verslag zoals gescand voor Krafts, Hempelmann en Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Rijping bleek demethylering te zijn

Niemand die er in de jaren 1890 bij betrokken was, wist wat "rijping" met methyleenblauw deed. Het antwoord kwam uit de industriële chemie. Heinrich August Bernthsen had in 1883 de uitgangsverbinding fenothiazine gesynthetiseerd, stelde in 1885 vast dat methyleenblauw tot die familie behoorde en toonde in dezelfde periode aan dat alkalische omstandigheden methylgroepen van de kleurstof verwijderen, waarbij de verbindingen ontstaan die nu azuren worden genoemd.

Bernard Nocht extraheerde in 1898 en 1899 de actieve fractie en kon die alleen Rot aus Methylenblau noemen, rood uit methyleenblauw. Michaelis identificeerde deze in 1901 als azuur I. Jenner introduceerde in 1899 absolute methanol als oplosmiddel voor het neerslag van de kleurstof, waardoor het niet langer nodig was bloeduitstrijkjes door verhitting te fixeren; Leishman en Reuter combineerden beide vooruitgangen; Wright publiceerde in 1902 een vereenvoudigde methode. Giemsa's bijdrage, eveneens uit 1902, was dat hij niet langer vertrouwde op een willekeurig gerijpte oplossing, maar in plaats daarvan afgemeten hoeveelheden van bekende kleurstoffen gebruikte. Vervolgens weigerde hij te publiceren hoe hij zuiver methyleenazuur maakte en verkocht hij de methode aan het laboratorium van Dr. Grübler, dat het product als azuur I op de markt bracht en beweerde dat alleen zijn versie de authentieke Giemsa-kleuring was.

Twee wereldoorlogen maakten het werk bij toeval af. Toen Duitse kleurstoffen niet meer verkrijgbaar waren, werkten Lillie, Roe en Wilcox aan Amerikaanse vervangingsmiddelen en ontdekten zij dat de beste kleuring afkomstig was van drie afzonderlijke bestanddelen: zuiver methyleenblauw, het afbraakproduct Azure B en eosine. Die drie blijven de belangrijkste bestanddelen van de kleuring die tegenwoordig wordt gebruikt om malaria te diagnosticeren, onder een naam waarin nu Malachowski, Wright en Giemsa samenkomen.

Figuur: ringvormen van Plasmodium falciparum in menselijke rode bloedcellen, gekleurd met een methode van het Romanowsky-type. De paarse structuur binnen de ring is het chromatine dat voor het eerst zichtbaar werd door Malachowski's met borax behandelde methyleenblauw. Afbeelding door Ernst Hempelmann, vrijgegeven in het publieke domein.

Eén naam, meerdere materialen

De jaren waarin die bestanddelen van elkaar werden gescheiden, lieten een probleem achter dat langer bleef bestaan dan de chemische kwestie zelf. Ralph Lillie trok in 1969 de grens tussen biologische kleurstoffen, "vervaardigd volgens strikte specificaties die passen bij hun delicate en veeleisende toepassingen", en niet-biologische kleurstoffen voor het kleuren van textiel, waarvoor "minder strenge en veeleisende productienormen nodig zijn". Beide soorten producten droegen dezelfde naam, en het verschil tussen beide was nooit alleen een kwestie van gradatie. Een specificatie die voor katoen is geschreven en een specificatie die voor een diagnostisch reagens is geschreven zijn niet onderling uitwisselbaar, en materiaal dat volgens de textielspecificatie was gemaakt was niet bedoeld om te worden ingeslikt.

Azure B is het duidelijkste voorbeeld. Het is de monogedemethyleerde vorm van methyleenblauw, heeft zelf meetbare farmacologische activiteit en was meer dan een eeuw lang als ongecontroleerd bestanddeel aanwezig in klinische preparaten van methyleenblauw voordat iemand de twee van elkaar scheidde. Eén onderzoeksgroep stelde vast dat menselijk weefsel dat bij autopsie na toediening van methyleenblauw was bemonsterd 5 tot 14 procent onveranderd methyleenblauw en 86 tot 95 procent Azure B bevatte. Of een bepaald preparaat Azure B moet bevatten, en binnen welke limiet, is een specificatiekwestie, en het onderzoek naar Azure B als onzuiverheid en metaboliet gaat vanaf dat punt verder.

In een specificatie ligt ook het praktische gevolg. Conformiteit met USP is de route naar de hoogste zuiverheid die de markt biedt, omdat het een volledige gepubliceerde teststandaard is en niet één enkele meting. De standaard omvat identiteit, gehaltebepaling, organische onzuiverheden waaronder de azuurkleurstoffen, resterende oplosmiddelen, elementaire onzuiverheden, gloeirest, microbiële limieten en bacteriële endotoxinen. Een certificaat dat een resultaat voor zware metalen vermeldt en dat USP-conformiteit noemt, heeft slechts één regel uit die lijst gerapporteerd.

Blupreme betrekt zijn methyleenblauw van een farmaceutische fabrikant en publiceert het volledige analysecertificaat, waarbij de volledige USP-specificatie wordt getest in plaats van alleen zware metalen. De handleiding voor het lezen van een analysecertificaat en wat de USP-aanduiding wel en niet aantoont leggen uit hoe het document aan de bewering kan worden getoetst.

Wat de geschiedenis rechtvaardigt, en wat niet

De historische lijn is reëel en langer dan de meeste productpagina's suggereren. Methyleenblauw werd in 1891 gebruikt voor de behandeling van malaria, werd in 1899 gerapporteerd als kalmerend middel bij geagiteerde psychose, en zijn zijketen loopt door naar quinacrine, chloroquine, promethazine en chlorpromazine. Ehrlichs artikel uit 1890 met Arthur Leppmann beschreef verlichting van neuralgische en reumatische pijn, waarna zij het gebruik van de kleurstof bij psychische aandoeningen overwogen maar besloten dit niet te testen.

Geen van die feiten stelt een modern gebruik vast. Het malariaresultaat uit 1891 bestond uit twee patiënten en een temperatuurgrafiek. Langdurige bekendheid met een molecuul is een reden om het te bestuderen, geen onderzoeksresultaat. De geschiedenis van de verbinding als geneesmiddel en de moderne onderzoeken naar malaria beantwoorden andere vragen dan die welke Ehrlich stelde, en de eindpunten moeten op hun eigen voorwaarden worden beoordeeld.

Er staat één detail in het historische overzicht dat eerder bij het heden dan bij het verleden hoort. Toen onderzoekers in de jaren 2000 in Burkina Faso malariastudies met methyleenblauw uitvoerden, moesten zij concurreren om materiaal van farmaceutische kwaliteit en meldden zij dat de prijs van de grondstof met ongeveer een factor honderd was gestegen zodra deze GMP-validatie had. Een kleurstof kon worden vervangen. Een geneesmiddel niet. Het onderscheid dat Lillie in 1969 maakte, is hetzelfde onderscheid dat vandaag bepaalt wat er in een fles zit.