Metylenblått og mitokondrier: elektrontransport og evidensen

Se for deg to preparater side om side. Begge inneholder hjernemitokondrier forgiftet med rotenon, et kjemikalie som blokkerer kompleks I i respirasjonskjeden. I det ene tilsetter forskeren en mikromolar dose metylenblått med pipette. Oksygenforbruket gjenopprettes delvis. Membranspenningen kommer delvis tilbake. En liten mengde ATP-syntese starter igjen. I kyvetten ved siden av forteller en peroksidsensor den andre halvdelen av historien: Produksjonen av hydrogenperoksid har økt flere ganger, ved hver testet dose og med hvert prøvde substrat.

Begge målingene er riktige. Metylenblått er en elektrontransportør som kan holde strømmen i gang forbi en skadet del av respirasjonskjeden, og den samme transportøren krever en pris i form av peroksid mens den gjør det. Holder du fast ved begge fakta samtidig, blir litteraturen om metylenblått og mitokondriefunksjon forståelig. Holder du bare fast ved det ene, fremstår stoffet som et mirakel eller en trussel, avhengig av hvilken artikkel du åpnet først.

Transportøren, enkelt forklart

Respirasjonskjeden er en stafett. Elektroner kommer inn ved kompleks I (fra NADH) eller ved kompleks II og beslektede flavinenzymer (fra suksinat og lignende donorer), passerer gjennom kompleks III til den mobile bæreren cytokrom c, og deretter gjennom kompleks IV til oksygen. Hver overlevering pumper protoner over den indre membranen, og gradienten som oppstår, driver ATP-syntesen. Blokkeres en stasjon, stilner kjeden oppstrøms.

Metylenblått trer inn som en parallell budbringer. Den oksiderte formen tar opp elektroner fra bærere oppstrøms og blir til den fargeløse, reduserte formen, leukometylenblått, som deretter leverer elektronene videre nedstrøms og blir blå igjen. De to formene er beskrevet i gjennomgangen av redoksparet, og den bredere stafettfunksjonen hører hjemme i den generelle mekanismeforklaringen. Det åpne spørsmålet er hvor budbringeren går inn i kjeden igjen: i kinolbindingslommen i kompleks III, kjent som Qo-setet, eller direkte ved cytokrom c. Hvilket leveringssted som dominerer, avhenger av betingelsene, slik analysen av omgåelse av kompleks III beskriver i detalj.

Hva tre gnagerstudier faktisk målte

Alle tre studiene brukte isolerte hjernemitokondrier, altså organeller fjernet fra cellen og suspendert i en definert buffer. Ingen intakte celler, ingen dyr som fikk doser, ingen forsøkspersoner. Konsentrasjonene gjelder badet rundt organellene, ikke en oral dose til mennesker. Holder vi fast ved den rammen, taler tallene tydelig.

Den første studien, med isolerte hjernemitokondrier fra marsvin ved 100 nanomolar til 2 mikromolar, kartla gevinst og kostnad i ett preparat. I friske mitokondrier økte fargestoffet oksygenforbruket i hvile, men lot ADP-stimulert respirasjon være uendret, så den koblede ATP-produksjonen ble ikke bedre. Ved blokkering av kompleks I gjenopprettet 2 mikromolar ATP-syntesen fra 46 til 93 nanomol per minutt per milligram, mot en normal rate på rundt 1109. Ved blokkering av kompleks III gjenopprettet samme dose ATP-produksjonen fra omtrent 46 til 63, mot en normal rate på rundt 910. Spenningen og kalsiumopptaket ble delvis gjenopprettet. Cyanidblokkering av kompleks IV kunne ikke omgås, noe som plasserer det nyttige leveringsstedet for elektronene oppstrøms for et fungerende kompleks IV. Hver gjenoppretting var statistisk reell og liten: ensifrede prosentandeler av normal ATP-produksjon.

Den andre studien, med mitokondrier fra hjernebarken hos mus ved rundt 1 mikromolar, bekreftet omgåelsen av kompleks I og satte en grense ved kompleks III. Rotenon reduserte respirasjonen fra omtrent 121 til under 2 nanomol oksygen per minutt per milligram, og fargestoffet løftet den til omtrent 21, rundt en sjettedel av normalen, mens membranspenningen ble nesten fullstendig gjenopprettet. Men etter blokkering av kompleks III ble verken respirasjonen eller spenningen gjenopprettet ved 1 til 5 mikromolar, og blokkeringen dempet det fargestoffdrevne peroksidsignalet. Forfatterne foreslo at det reduserte fargestoffet leverer elektronene sine ved Qo-setet i kompleks III: Når dette setet er opptatt, har budbringeren ikke noe sted å levere.

Den tredje studien, med hjernemitokondrier fra mus, rotter og marsvin hovedsakelig ved 2 mikromolar, undersøkte uenigheten direkte og fant at en blokkering av kompleks III kan omgås. Da Qo-setehemmeren myksotiazol reduserte basal respirasjon med 88 prosent, gjenopprettet fargestoffet oksygenforbruket til omtrent 62 prosent av den ublokkerte raten. I en direkte test reduserte en halv mikromolar eksogent cytokrom c selv mens kompleks III var blokkert, noe som støtter en rute fra NADH via fargestoffet til cytokrom c og videre til kompleks IV. Men den gjenopprettede respirasjonen oppførte seg unormalt: Tilsatt ADP senket oksygenforbruket i stedet for å øke det, og blokkering av ATP-syntesen stimulerte respirasjonen. Spenningen ble bare delvis gjenopprettet ved repolarisering. Høyt oksygenforbruk med omvendt kobling er ikke normal energiproduksjon.

Hvorfor laboratoriene er uenige, og hva som avklarer det

Artsforskjeller holder ikke som forklaring. Den tredje gruppen gjentok arbeidet i tre gnagerarter og fikk den samme kvalitative omgåelsen i alle, også i musestammen der omgåelsen tidligere var rapportert fraværende. Det som i stedet varierer, er konsentrasjon (1 versus 2 mikromolar), hemmerdoser, buffere, isoleringsmetoder og fremfor alt energitilstanden som sammenlignes: Omgåelsen er tydeligst før ADP tilsettes, akkurat der den paradoksale ADP-responsen oppstår. Et redelig diagram viser derfor to betingelsesavhengige leveringssteder, ett ved Qo-setet og ett ved cytokrom c. Budbringeren leverer der den lokale kjemien tillater det.

Prisen i form av peroksid

Kostnadssiden er like konsekvent som gjenopprettingssiden. I marsvinforsøkene økte fargestoffet frigjøringen av peroksid under alle testede betingelser, i hvile, under ATP-syntese og ved kjemisk svekkelse, med alle tre substratene. Under ATP-syntese steg produksjonen fra omtrent 148 til over 1500 pikomol per minutt per milligram ved 1 mikromolar, og selv 100 nanomolar mer enn firedoblet signalet. Fargestoffet bremset også fjerningen av peroksid med omtrent en faktor på 2.6, så signalet gjenspeiler raskere dannelse kombinert med langsommere fjerning. Den foreslåtte kjemien er direkte reduksjon av oksygen ved hjelp av redusert fargestoff uten påvisbart superoksid, men dette er fortsatt en tolkning snarere enn et bevist trinn.

Museforsøkene kompliserer bildet på en nyttig måte. Peroksid økte bratt med dosen, fra en grunnverdi nær 76 til nesten 2000 pikomol per minutt per milligram ved 2 mikromolar, men blokkering av kompleks III dempet den fargestoffdrevne komponenten. Hvis peroksid bare kom fra redusert fargestoff som reagerte med oksygen, skulle blokkering av kjeden ikke ha så stor betydning. Det har den, så kjeden deltar. Gjennomgangen av antioksidant- og prooksidantvirkning setter denne dobbeltheten i en bredere sammenheng, og analysen av oksygen versus ATP forklarer hvorfor oksygentall alene aldri kan avgjøre en påstand om energi.

Gjenoppretting er ikke reparasjon

Formuleringen som bør pensjoneres, er «reparerer metylenblått mitokondrier». Reparasjon ville bety en varig utbedring: gjenoppbygde komplekser, kobling som vedvarer etter at legemiddelet er borte, gjenoppretting i intakte celler og deretter forbedret funksjon i en levende organisme. Ingen av de tre artiklene viser dette. De viser akutt omdirigering i nylig isolerte organeller under kunstig kjemisk blokkering, med ATP-produksjon på små brøkdeler av normalen og noen ganger direkte merkelig kobling. Rotenon og antimycin er laboratorieverktøy, ikke modeller for aldring eller mitokondriesykdom hos mennesker, og ingenting her kan overføres til mer energi for en frisk person. Det er et eget evidensspørsmål med sin egen litteratur om mennesker.

Tre avgrensninger holder enhver biohacking-konklusjon redelig. For det første er konsentrasjonen i badet ikke en dose: 0.1 til 2 mikromolar rundt isolerte organeller sier ingenting om hvilken oral mengde som gir denne frie konsentrasjonen ved et mitokondrium i menneskehjernen, særlig siden fargestoffet akkumuleres eller frigjøres avhengig av selve membranspenningen. For det andre er oksygen ikke energi: Fargestoffet kan øke oksygenforbruket gjennom syklisk elektrontransport og lekkasje så vel som gjennom produktiv fosforylering, så respirometri uten målinger av ATP og spenning kan ikke begrunne en påstand om energi. For det tredje må gevinst og belastning stå i samme setning: Enhver beskrivelse av gjenopprettet spenning eller ATP som utelater den samtidige peroksidøkningen, gjengir forsøket feil. Beslektede forbehold omfatter NAD-redoksbalanse, formen på doseresponsen og veiledningen til analysemetoder.

En praktisk fotnote: Transportfunksjonen er en egenskap ved akkurat dette molekylet. Demetylerte slektninger som Azure B er også redoksaktive, men oppfører seg annerledes, så en delvis nedbrutt løsning er et annet forsøk enn et intakt fargestoff. Det er én grunn til å kreve full farmakopéspesifikasjon og et publisert batchdokument fremfor en screening bare for metaller. Lysdrevet kjemi gir et tilsvarende forbehold ved bruk under belysning, omtalt under kombinasjoner med rødt lys.

Den avgrensede påstanden står seg gjennom alt dette og er verdt å beholde: Metylenblått kan fungere som en betingelsesavhengig elektronbudbringer i skadede, isolerte mitokondrier og delvis opprettholde strømmen til en pris i form av peroksid. Alt utover dette, energi, lengre levetid, reparasjon, venter på evidens som disse studiene aldri var utformet for å gi.