Eksperimen yang mengaitkan metilena biru dengan respirasi sel

Darah manusia yang telah dibuang fibrinnya, dipanaskan pada 37 °C selama tiga jam, menggunakan kira-kira dua peratus daripada oksigen yang terkandung di dalamnya. Tambahkan sedikit metilena biru sebelum inkubasi, dan darah yang sama menggunakan kira-kira enam puluh lima peratus. Tiada apa-apa pada sel yang berubah. Hanya larutannya yang berubah.

Angka itu berasal daripada makalah tahun 1928 oleh George Harrop dan E. S. Guzman Barron di Johns Hopkins, dan menjadi asal usul pernyataan yang sering diulang bahawa metilena biru meningkatkan respirasi sel. Pernyataan itu tidak salah, tetapi skopnya lebih sempit daripada yang disangka.

Apa yang sebenarnya diukur oleh angka dalam jadual

Hasil akhir yang diukur ialah pengambilan oksigen, yang ditentukan melalui analisis gas. Harrop dan Barron menapis darah yang baru diambil melalui kapas pada 10 °C untuk menyingkirkan sel darah putih, menepukan sampel dengan oksigen, membahagikannya, menambahkan pewarna pada satu bahagian, dan menganalisis kedua-duanya selepas inkubasi. Kiraan leukosit jarang melebihi kira-kira seribu bagi setiap milimeter padu. Penggunaan oksigen dilaporkan sebagai bahagian daripada kandungan oksigen awal sampel yang telah hilang.

Mereka juga mengukur karbon dioksida, tetapi kaedah itu menimbulkan masalah. Darah yang telah dibuang fibrinnya membebaskan sehingga dua milimol karbon dioksida bagi setiap 100 mL dalam jam pertama inkubasi atas sebab yang tidak berkaitan dengan tindak balas yang dikaji, maka hasil bahagi respirasi daripada darah penuh tidak dapat digunakan. Hanya sel yang telah dibasuh dalam larutan Locke memberikan angka yang dapat ditafsirkan, dan angka itu berkumpul antara 0.73 hingga 0.80, dengan atau tanpa pewarna.

Butiran itu bukan perkara remeh. Dalam makalah-makalah ini, "respirasi" bermaksud pertukaran gas dalam bekas tertutup. Jurang antara penggunaan oksigen dengan penghasilan tenaga yang berguna diteliti secara berasingan dalam apa yang boleh dan tidak boleh diberitahu oleh penggunaan oksigen tentang ATP.

Pewarna memberi peningkatan terbesar pada sel yang paling kurang berespirasi

Eritrosit mamalia matang hampir tidak mempunyai penggunaan oksigen yang dapat diukur. Eritrosit burung yang mempunyai nukleus pula mempunyai penggunaan oksigen yang dapat diukur. Harrop dan Barron menguji kedua-duanya, dan perbezaan itu menjadi asas utama hujah mereka.

Dalam sampel mamalia, pewarna menghasilkan peningkatan sebanyak dua puluh hingga lima puluh kali ganda. Dalam darah angsa, yang selnya sudah berespirasi, pewarna tidak pernah meningkatkan kadarnya melebihi dua kali ganda. Semakin tinggi respirasi awal, semakin kecil peningkatan yang dapat diberikan oleh pewarna.

Pola yang sama muncul dalam satu spesies. Sampel manusia daripada pesakit polisitemia vera, yang mengandungi sel tidak matang, menggunakan 11.3 peratus daripada oksigennya tanpa pewarna, berbanding 2.8 peratus bagi sel yang telah dibasuh daripada penderma sihat. Pewarna hanya meningkatkannya kepada 63.4 peratus, iaitu peningkatan enam kali ganda, sedangkan sel normal meningkat hampir tiga puluh kali ganda. Pewarna menjadikan tingkah laku sel matang lebih menyerupai sel tidak matang, selaras dengan apa yang dinyatakan oleh penulis.

Sianida sepatutnya menghentikannya

Sianida diketahui menghentikan pengoksidaan sel. Namun, Harrop dan Barron tetap menambahkannya bersama pewarna.

Keputusan darah lembu mewakili pola ini. Kandungan oksigen menurun daripada 22.61 kepada 22.03 peratus mengikut isi padu dalam tempoh tiga jam tanpa sebarang bahan tambahan. Dengan metilena biru, kandungannya menurun kepada 12.84. Dengan metilena biru dan kalium sianida pada kepekatan satu per lima ribu molar, kandungannya menurun kepada 12.74. Kesan pewarna pada asasnya tidak terjejas.

Rajah: rekod mikrorespirasi berterusan eritrosit manusia. Anak panah menandakan penambahan metilena biru. Sebelumnya, lengkung hampir mendatar; selepasnya, lengkung meningkat secara berterusan. Diterbitkan semula daripada Harrop dan Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Kesimpulan mereka ialah pewarna bertindak sebagai pembawa oksigen, "membekalkan bahan yang telah hilang daripada eritrosit mamalia dewasa yang tidak bernukleus." Dua tahun kemudian, Michaelis dan Salomon di Institut Rockefeller merumuskan pertikaian itu dalam bentuk yang berkekalan. Sama ada kesan pewarna itu merupakan "sifat kebetulan pewarna tersebut", atau pewarna itu merupakan "model bagi suatu bahan yang tidak diketahui dalam organisma." Persoalan antara dua kemungkinan itu masih belum diselesaikan. Yang berubah ialah sel kini dapat diterangkan dengan jauh lebih tepat.

Ekstrak hati menghasilkan kesan yang sama

Michaelis dan Salomon menunjukkan bahawa ekstrak organ yang diperoleh menggunakan air sejuk menghasilkan rangsangan yang sama. Hati tikus memberikan kesan paling kuat, diikuti buah pinggang, limpa dan testis. Otak, otot dan serum darah memberikan sedikit kesan atau tiada kesan langsung.

Mereka kemudian menguji ekstrak itu terhadap karbon monoksida. Respirasi yang dicetuskan oleh ekstrak atau pewarna tidak berubah dalam campuran 98 peratus karbon monoksida dan 2 peratus oksigen. Campuran gas yang sama menghalang respirasi yis dan eritrosit ayam yang bernukleus sebanyak kira-kira 60 hingga 80 peratus, selaras dengan huraian Warburg tentang enzim respirasi yang sensitif terhadap karbon monoksida. Oleh itu, bahan tisu yang belum dikenal pasti itu bukan enzim Warburg.

Beberapa calon bahan tersingkir sepanjang kajian. Glutation tereduksi dan sisteina hanya menghasilkan penggunaan oksigen yang diperlukan untuk pengoksidaan bahan itu sendiri. Koenzim Harden dan Young diketepikan kerana otot mengandungi paling banyak koenzim itu tetapi menunjukkan antara kesan yang paling kecil. Sitokrom Keilin, yang dinamakan beberapa tahun sebelumnya, menghadapi percanggahan yang sama. Cadangan mereka sendiri, bahawa bahan aktif itu berasal daripada nukleus sel, mereka sifatkan sebagai sekadar cadangan.

Kesan itu bergantung pada beberapa syarat

Sel perlu kekal utuh. Hemolisis akibat air suling atau pembekuan berulang menghapuskan tindak balas terhadap pewarna dan ekstrak, manakala hemolisis separa mengurangkannya secara berkadar.

Gula juga diperlukan. Glukosa, fruktosa dan sukrosa menyokong respirasi yang dicetuskan oleh pewarna; manitol tidak. Tanpa gula, tiada respirasi berlaku langsung, dan pewarna kelihatan merosakkan sel dalam proses itu, maka glukosa yang ditambahkan satu atau dua jam kemudian tidak memulihkannya. Penulis mencadangkan bahawa pewarna mengoksidakan komponen struktur yang diperlukan oleh sel.

Pendedahan kepada cahaya meningkatkan kesan pewarna dengan ketara, walaupun kesannya jelas dalam keadaan gelap. Pewarna lain yang boleh diturunkan menunjukkan tingkah laku berbeza: toluilena biru menyamai atau melebihi metilena biru, manakala indigo disulfonat hampir tidak memberikan kesan. Tiada hubungan yang jelas muncul antara potensi pengoksidaan-penurunan sesuatu pewarna dengan magnitud kesannya, yang dikaitkan oleh penulis dengan kebolehtelapan membran dan ketoksikan.

Kesan itu berkait dengan penapaian, bukan respirasi

Kajian Barron pada 1930 beralih daripada suspensi sel kepada hirisan tisu organ tikus normal dan tumor yang dipindahkan.

Dalam tisu tanpa glikolisis aerob, metilena biru tidak memberikan kesan atau sedikit mengurangkan penggunaan oksigen: buah pinggang kira-kira 14 peratus, pankreas kira-kira 14 peratus, hati kira-kira 5 peratus. Dalam tisu yang menjalankan penapaian dalam keadaan beroksigen, pewarna meningkatkan penggunaan oksigen: limpa kira-kira 8 peratus, otak kira-kira 13 peratus. Peningkatan pada tumor berkisar daripada kira-kira 27 peratus dalam karsinoma payudara manusia hingga lebih daripada 80 peratus dalam sarkoma Rous pada ayam, secara kasar berkadar dengan glikolisis aerob setiap tisu.

Rajah: setiap titik mewakili satu jenis tisu. Paksi mendatar ialah glikolisis aerob; paksi menegak ialah perubahan penggunaan oksigen selepas penambahan metilena biru. Data daripada Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Jadual 6, PMID 19869777.

Eksperimen sianida kemudian menghasilkan pola yang bertentangan. Apabila respirasi dalam tisu yang sebelumnya tidak memberikan tindak balas itu disekat dengan sianida dan penapaian menjadi ketara, pewarna sekali lagi meningkatkan penggunaan oksigen: buah pinggang kira-kira 59 peratus, hati kira-kira 19 peratus, limpa kira-kira 286 peratus, testis kira-kira 200 peratus.

Barron mencadangkan bahawa pewarna itu boleh digunakan sebagai ujian bagi keupayaan penapaian sesuatu sel atau tisu, dan mengakhiri makalah dengan satu spekulasi: pembiakan kultur tumor selama beberapa generasi dalam medium yang mengandungi pewarna mungkin suatu hari nanti menjadikan metabolisme tumor secara kekal menyerupai metabolisme tisu normal. Itu ialah persoalan penyelidikan yang ditulis pada 1930. Ia bukan dakwaan rawatan.

Apa yang tidak mungkin diukur oleh eksperimen tersebut

Pada 1928 dan 1930, "respirasi" bermaksud penggunaan oksigen. Adenosina trifosfat pertama kali dilaporkan pada 1929, dan pembuktian bahawa mitokondria yang diasingkan mengesterkan fosfat sambil memindahkan elektron muncul pada 1949. Tiada satu pun makalah awal metilena biru dapat mengukur penghasilan tenaga, dan tiada satu pun mendakwa berbuat demikian.

Sel itu sendiri merupakan masalah kedua. Eritrosit mamalia matang tidak mengandungi mitokondria. Semasa peringkat retikulosit, sel menyingkirkan mitokondria dan ribosom melalui autofagi terpilih, sebab itulah sel darah merah matang bergantung pada glikolisis dan menggunakan laluan pentosa fosfatnya terutamanya untuk NADPH, bukannya ATP. Dalam eksperimen 1928, tiada rantai pengangkutan elektron yang hadir untuk dibaiki. Apa-apa pun yang menggunakan oksigen itu, ia melakukan sesuatu yang lain.

Proses lain itu kini dapat dihuraikan dengan agak baik. Metilena biru menerima elektron daripada bahan penurun dalam sel lalu menjadi leukometilena biru, yang dioksidakan semula oleh oksigen molekul, melengkapkan kitaran itu. Dalam sel darah merah manusia, flavin reduktase yang bergantung pada NADPH dan disulfida reduktase yang berkaitan menjalankan langkah penurunan tersebut. Kajian pada 1976 yang menggunakan glukosa berlabel mendapati bahawa pewarna merangsang laluan heksosa monofosfat, bahawa kesan pada kepekatan rendah bergantung pada oksihemoglobin, dan bahawa kepekatan yang lebih tinggi, 0.1 mM, menghasilkan hidrogen peroksida. Pewarna tereduksi yang bertemu oksigen menghasilkan peroksida, bukan ikatan fosfat.

Dalam mitokondria, gambaran ini lebih dipertikaikan daripada yang diakui oleh ringkasan popular. Satu aliran penyelidikan berpendapat bahawa pewarna mengambil elektron dari kawasan kompleks I dan menyerahkannya kepada sitokrom c. Satu lagi mendapati bahawa dalam mitokondria otak mencit, pewarna tidak dapat memulihkan respirasi selepas sekatan oleh antimisin, dan sebaliknya mengenal pasti tapak pengikatan ubikuinol pada kompleks III sebagai lokasi penerima elektron. Kajian ketiga mendapati bahawa kepekatan rendah meningkatkan penggunaan oksigen pada keadaan rehat tanpa mengubah respirasi yang dirangsang oleh ADP. Pernyataan paling langsung tentang perkara ini ialah penggunaan oksigen yang dicetuskan oleh metilena biru langsung tidak bergantung pada fosforilasi oksidatif: ia berterusan apabila rantai respirasi dihalang, dan dalam sediaan yang tidak mempunyai rantai itu.

Pengukuran langsung tentang jurang antara kedua-dua kuantiti itu juga tersedia. Dalam mitokondria hati tikus yang diasingkan, peningkatan kepekatan pewarna menurunkan nisbah kawalan respirasi dan menyebabkan pembengkakan, yang dihuraikan oleh penulis sebagai penyahgandingan fosforilasi oksidatif. Dalam hati tikus yang diperfusi, metilena biru meningkatkan penggunaan oksigen sementara nisbah ATP kepada ADP menurun.

Rekod klinikal membawa mesej yang sama. Methemoglobinemia dirawat dengan kira-kira satu hingga dua miligram metilena biru bagi setiap kilogram secara intravena, melalui laluan penurunan yang bergantung pada NADPH, dan dos yang lebih besar menyebabkan keadaan yang sedang dirawat itu. Ulasan yang sama menyatakan bahawa kesan antidot paling besar dalam eritrosit utuh dan berkurang apabila hemolisis berlaku; ini ialah dapatan hemolisis tahun 1930 yang muncul semula tujuh puluh tiga tahun kemudian dalam konteks hospital. Sebatian yang kesan bermanfaat dan kesan memudaratkannya terletak pada sisi bertentangan suatu ambang dos bukanlah sebatian yang dosnya patut disimpulkan daripada pengukuran penggunaan oksigen.

Mengapa kelompok pengeluaran perlu dibincangkan

Harrop dan Barron menyedari sesuatu yang wajar diteliti semula. Metilena biru sendiri menghasilkan jalur dalam spektroskop di antara dua jalur ciri methemoglobin, "yang mudah menyebabkan kekeliruan apabila diperiksa sepintas lalu." Pewarna boleh menyerupai bahan yang sedang dicari.

Masalah yang sama juga wujud dari segi kimia. Fenotiazina berkaitan yang hadir sebagai komponen minor mempunyai tingkah laku redoks, kebolehtelapan dan ketoksikannya sendiri. Satu kes yang didokumenkan menunjukkan kepentingannya secara nyata: dalam kajian pengiodinan metilena biru, sampel yang mengandungi kira-kira 7 hingga 8 peratus Azure B menghasilkan terutamanya Azure B teriodin, maka bendasing itu, bukannya metilena biru, yang mendominasi tindak balas.

Sesiapa yang menggunakan metilena biru sebagai reagen, sama ada di makmal, di meja pewarnaan atau dalam akuarium, sedang bekerja dengan bahan yang tidak diperincikan melainkan kelompok pengeluarannya telah dicirikan. Bahan berkaitan, identiti, bendasing unsur, sisa pelarut dan sisa selepas pembakaran merupakan sebahagian daripada eksperimen, bukannya sekadar urusan dokumentasi. Blupreme mendapatkan metilena birunya daripada pengilang farmaseutikal dan menerbitkan sijil analisis lengkap, dengan menguji keseluruhan spesifikasi USP dan bukan logam berat sahaja; panduan membaca sijil analisis dan apa yang boleh dan tidak boleh dipastikan oleh penetapan gred USP menerangkan cara menyemak dokumen berbanding dakwaan.

Angka itu betul

Eksperimen pada 1928 dan 1930 dijalankan dengan teliti, dan pemerhatian utamanya masih bertahan: pewarna yang boleh diturunkan dapat menyebabkan sel yang hampir tidak berespirasi menggunakan oksigen pada kadar berkali-kali ganda lebih tinggi daripada kadar rehatnya, tanpa melalui langkah yang disekat oleh sianida.

Kesilapan muncul kemudian, apabila "respirasi" ditafsirkan menurut makna modennya. Pengukuran pertukaran gas memberitahu anda bahawa elektron sampai kepada oksigen. Ia tidak memberitahu anda bahawa mana-mana elektron itu digunakan untuk menghasilkan ATP, dan dalam sel tanpa mitokondria, jurang antara kedua-dua pernyataan itu adalah sebesar-besarnya. Gambaran menyeluruh tentang tindakan metilena biru dalam sel meletakkan perbezaan yang sama dalam kerangka yang lebih luas, manakala sejarah sebatian ini daripada pewarna kepada ubat menerangkan bagaimana pewarna tekstil ini mula-mula sampai ke eksperimen tersebut.