Metileno mėlynojo identifikavimas laboratorijoje: infraraudonųjų spindulių spektrai ir papildomi metodai

Įsivaizduokite, kad trys laboratorijos gauna tuos pačius mėlynus miltelius. Pirmoji užrašo infraraudonųjų spindulių spektrą ir nustato, kad tai metileno mėlynasis. Antroji atlieka chromatografinį tyrimą ir praneša apie 0.4% Azure B. Trečioji tiria kristalus rentgeno spindulių difrakcija ir nustato hidrato formą. Visos trys yra teisios, tačiau nė viena neatsakė į kitus du klausimus. Painiava prasideda tada, kai vienas rezultatas laikomas atsakymu į visus tris.

Šiame straipsnyje šie klausimai atskiriami. Identifikavimas infraraudonųjų spindulių spektroskopija patvirtina molekulinę tapatybę, lyginant su etalonine medžiaga. Chromatografija nustato sudėtį. Difrakcija nustato kietosios būsenos formą. Teigiama tapatybės patikros išvada nėra grynumo sertifikatas.

Identifikavimas infraraudonųjų spindulių spektroskopija gerai atsako į vieną klausimą

Farmakopėjinis metileno mėlynojo tapatybės tyrimas yra spektro palyginimas su etalonu, o ne smailių kontrolinis sąrašas. USP metileno mėlynojo monografijos peržiūroje nurodyta, kad tapatybės tyrimui A taikoma infraraudonųjų spindulių spektroskopija su ATR optika arba kalio bromido tablete. Mėginio spektras turi atitikti USP etaloninės medžiagos spektrą, o mėginys ir etalonas turi būti paruošti ir jų spektrai užrašyti lygiavertėmis sąlygomis. Išvadą lemia ne fiksuotas diagnostinių banginių skaičių sąrašas, o spektrų sutapimas juos uždėjus vieną ant kito.

Toks pasirinkimas atspindi metileno mėlynojo FTIR spektrų ypatumus. Ryškiausios juostos yra pirštų atspaudų srityje. Literatūroje pagrindinė konjuguotų žiedų juosta nuosekliai priskiriama sričiai ties 1590–1600 cm-1, kur susijungia aromatinių anglies–anglies ir anglies–azoto ryšių tempimo virpesiai. Kitos juostos ties 1490 ir 1390 cm-1 susijusios su žiedų, anglies–azoto ir anglies–vandenilio deformaciniais virpesiais. Juostos ties 1355 ir 1330 cm-1 apima dimetilamino grupių anglies–azoto ryšius ir metilo grupių deformacinius virpesius. Juostos ties 1225–1250 cm-1 priskiriamos heterocikliniam karkasui, o juostos ties 1170–1130 ir 1066 cm-1 susijusios su anglies–sieros ryšiais; aromatiniai C-H lenkimo virpesiai yra ties 880 cm-1. Tempimo virpesiai pasireiškia aukštesnių banginių skaičių srityje: aromatiniai C-H – ties 3040 cm-1, o N-metilo C-H – maždaug tarp 2900 ir 3000 cm-1. Paskelbti priskyrimai skiriasi detalėmis, nes fenotiaziniumio karkasas virpa kaip susieta sistema, todėl bet kurią atskirą priskyrimų lentelę laikykite vienu iš paskelbtų variantų, o ne vieninteliu galimu.

Verta atkreipti dėmesį į du mėginio paruošimo poveikius, nes jie keičia metileno mėlynojo IR spektrus nekeisdami paties dažiklio. Pirma, hidratuota medžiaga turi plačią O-H juostą ties 3300–3500 cm-1 ir vandens lenkimo virpesių juostą ties 1630–1640 cm-1, o skirtingos hidrato formos išmatuojamai paslenka pirštų atspaudų srities juostas. Antra, KBr tabletės matrica yra higroskopiška: sugerta drėgmė sukuria juostas būtent šiose vandens srityse ir gali būti klaidingai palaikyta mėginio hidrato vandeniu. Tiriant ATR metodu KBr matricos išvengiama, tačiau ATR juostų intensyvumas priklauso nuo įsiskverbimo gylio, kuris kinta su banginiu skaičiumi, todėl tų pačių miltelių ATR ir pralaidumo spektrų negalima tiesiogiai sutapatinti uždėjus vieną ant kito. Iš farmakopėjinio reikalavimo kyla praktinė taisyklė: lyginkite tuo pačiu metodu užrašytus mėginio ir etalono spektrus ir dokumentuokite, kuris metodas naudotas. Apie šiuos spektrus lemiančią katijono, druskos ir hidratų chemiją skaitykite metileno mėlynojo struktūros ir savybių apžvalgoje.

Analitinių metodų pasirinkimo lentelė

Ši lentelė padeda pasirinkti metodą. Skaitydami eilutę sužinosite, į kokį klausimą metodas atsako, ką patvirtina reikalavimus atitinkantis rezultatas ir kas lieka neįrodyta.

Kodėl infraraudonųjų spindulių spektrų atitiktis nėra grynumo sertifikatas

Tapatybės atitiktis leidžia atmesti, kad tai kitas dažiklis. Ji nenustato visos mėginio sudėties. Svarbiausi yra trys apribojimai.

Pirma, artimi giminingi junginiai infraraudonųjų spindulių srityje atrodo panašiai. Azure B nuo metileno mėlynojo skiriasi viena metilo grupe, todėl jo spektras labai panašus į metileno mėlynojo spektrą. Mišinio, kuriame yra keli procentai Azure B, spektras vis tiek gerai sutampa su metileno mėlynojo etalono spektru. Šios priemaišos aptikimas yra chromatografijos užduotis, aptariama metileno mėlynojo priemaišų ir tyrimo metodų vadove.

Antra, infraraudonųjų spindulių spektroskopija tiria visą mėginį ir pasižymi ribotu jautrumu mažais kiekiais esantiems komponentams. Nedideli giminingų dažiklių, likutinių tirpiklių ar neorganinių liekanų kiekiai pasislepia po pagrindinėmis juostomis. Papildomų smailių nebuvimas yra silpnas priemaišų nebuvimo įrodymas.

Trečia, visą palyginimą lemia etaloninė medžiaga. Suiręs, dėl hidratacijos pakitusį spektrą turintis ar netinkamai tvarkytas etalonas pakeičia vertinimo kriterijus. Tą patį daro nesuderintas metodų derinys, pavyzdžiui, kai mėginio ATR spektras vertinamas pagal KBr etalono spektrą. Prie kiekvienos išvados užrašykite etalono partiją, metodą ir paruošimą.

Mišiniai reikalauja dar vieno atsargumo. Iš esmės sutampantis spektras su juostų peteliais ar intensyvumo anomalijomis nėra teigiama išvada su išlygomis. Tai signalas prieš identifikuojant atskirti mėginio komponentus.

Papildomi metodai praktikoje

Metileno mėlynojo HPLC tyrimas atsako į sudėties klausimą, į kurį infraraudonųjų spindulių spektroskopija atsakyti negali. Dabartiniame farmakopėjiniame metode naudojama fenilo tipo kolonėlė su vandens ir acetonitrilo gradientu, kuriame yra trifluoracto rūgšties, o detekcija atliekama ties 246 nm, ne regimojoje srityje. Tapatybė nustatoma pagal sulaikymo laiko atitiktį etaloninei medžiagai; tas pats palyginimas naudojamas ir kiekybiniam nustatymui. Organinių priemaišų tyrime Azure B identifikuojamas naudojant atskirą jo etaloninę medžiagą: santykinis sulaikymas yra apie 0.8, palyginti su metileno mėlynojo 1.0, ir reikalaujama didelės skiriamosios gebos tarp šių dviejų smailių. Atkreipkite dėmesį į bangos ilgio pasirinkimą: demetilinimo serijos sugertis palaipsniui slenka raudonosios srities link – nuo tionino ties 600 nm per Azure C, Azure A ir Azure B iki metileno mėlynojo ties 670 nm. Todėl ties 660 nm nustatytas detektorius į šios serijos junginius reaguoja nevienodai ir kai kurių homologų kiekį parodo mažesnį, nei jis yra. Kai reikia visos serijos profilio, taikytinas C18 LC-MS/MS metodas su kiekvienos analitės tinkamumo požiūriu patikrintais etalonais.

Miltelių difrakcija atsako į kietosios būsenos klausimą, kurio informaciją abu pirmiau aptarti metodai sunaikina arba ignoruoja: ištirpinus miltelius chromatografiniam tyrimui, informacija apie kristalus prarandama, o molekuliniai virpesiai atskleidžia ryšius, ne tolimąją struktūrinę tvarką. Difraktogramos leidžia atskirti hidratų fazes ir įvertinti kristališkumą, o metileno mėlynajam tokio tyrimo reikia labiau nei daugumai medžiagų. Rager ir kolegų kietosios būsenos tyrimuose nustatytos penkios skirtingos hidratų struktūros: pentahidratas, du dihidratai, monohidratas ir tarpinis hidratas; tarp apibūdintų formų tikro trihidrato nerasta. Čia svarbu, kaip mėginys tvarkomas laboratorijoje: drėgmė ir temperatūra keičia hidratų stabilumą, o intensyvus malimas gali pakeisti fazę arba sumažinti kristališkumą, todėl kontroliuokite ir dokumentuokite santykinę drėgmę bei temperatūrą ir malkite kuo mažiau. Hidratų ženklinimas ir jo poveikis sveriamai masei plačiau aptariami straipsnyje apie metileno mėlynojo hidratų formas ir ženklinimą.

UV-Vis sugertis atlieka papildomą vaidmenį. Gerai žinomi maksimumai patvirtina tikėtiną tirpalo elgesį ir leidžia nustatyti koncentraciją, tačiau mėlynas tirpalas, sugeriantis šviesą ties tikėtinu bangos ilgiu, tik dera su metileno mėlynojo savybėmis, bet neįrodo jo tapatybės, nes giminingi dažikliai sugeria šviesą gretimose srityse.

Ko paklausti prieš perkant

Šiuos skirtumus paverskite klausimais tiekėjui. Klauskite, kuri partija buvo tirta, kokiu metodu nustatyta tapatybė, ar HPLC priemaišų tyrime naudota Azure B etaloninė medžiaga ir ar hidrato forma buvo nustatyta, ar tik numanyta. Svarbiausia – paklauskite, ar sertifikatas apima visą specifikaciją, ar tik pasirinktus tyrimus. Daugelis pardavėjų, teigiančių, kad produktas atitinka farmakopėjos reikalavimus, tiria tik sunkiuosius metalus, todėl tapatybės, kiekybinio nustatymo, organinių priemaišų, tirpiklių ir mikrobiologiniai klausimai lieka neatsakyti.

Blupreme, bendradarbiaudama su farmaciniu metileno mėlynojo gamintoju, atlieka visus USP specifikacijoje numatytus tyrimus, apimančius tapatybę, grynumą, organines priemaišas, likutinius tirpiklius, elementines priemaišas, kaitinimo liekaną, mikrobiologines ribas ir bakterinius endotoksinus. Kiekvienos partijos viešas analizės sertifikatas skelbiamas Blupreme kokybės tyrimų puslapyje, todėl kiekybinio nustatymo skaičiavimo pagrindą ir priemaišų rezultatus galima perskaityti tiesiogiai, o ne numanyti. Net ir rezultatams, artimiems 100%, būtina nurodyti skaičiavimo pagrindą, kaip paaiškinta vadove apie kiekybinio nustatymo rezultatus, viršijančius 100 procentų. Tapatybės atitiktis pradeda tyrimą. Išsamūs duomenys jį užbaigia.