메틸렌 블루의 역사: 염료에서 의약품과 연구 물질로

메틸렌 블루는 약국에 도달하기 전에 환자에게 먼저 도달했다.

Paul Guttmann과 Paul Ehrlich가 1891년에 발표한 말라리아에서의 이 염료 사용 보고서에는 두 개의 체온 그래프가 실려 있다. 두 번째 그래프는 13 July부터 5 August까지를 다루며, 매일 시행한 처치가 여백을 따라 기록되어 있다. 18일과 19일 July의 항목에는 "1 × 0,05 Methylenblau"라고 적혀 있다. 그 뒤 며칠에는 같은 양을 다섯 번, 일곱 번 투여한 것으로 기록되어 있고, 22 July에는 소량의 퀴닌도 기록에 추가된다. 그래프 전반부에서 37 °C와 39.5 °C 사이를 오르내리던 발열선은 염료가 등장한 뒤 평탄해지고, 나머지 3주 동안 약 36 °C와 37.5 °C 사이에 머문다.

환자는 두 명 중 한 명이었으며, 논문에서는 각각 가사 노동자와 선원으로 묘사되었다. 그들이 투여받은 화합물은 이미 15년 동안 상업용 섬유 염료로 사용되고 있었고, 이 두 남성은 특정 생물체를 표적으로 하는 완전 합성 약물로 치료받은 최초의 기록 사례들 가운데 하나다.

먼저 등장한 것은 염료였다

최초로 상업적 성공을 거둔 합성 염료는 William Henry Perkin이 1856년에 만들었다. Perkin은 18세였고, 부활절 휴가 동안 집에 마련한 실험실에서 퀴닌을 합성하려 하고 있었다. 그러나 대신 검은 잔류물을 얻었고, 그것을 녹인 뒤 실크에 선명하게 고착되는 색을 발견했다. 그는 1856년 August에 특허를 냈고, 1857년 말에는 London의 실크 염색 공장에 공급하는 공장을 운영하고 있었다.

1875년 Adolf von Baeyer는 붉은 염료를 합성하고, 새벽을 뜻하는 그리스어 Eos에서 따와 eosin이라는 이름을 붙였다. 1876년 당시 Badische Anilin- und Soda-Fabrik의 연구소장이었던 Heinrich Caro는 Baeyer와 함께 메틸렌 블루를 면직물용 아닐린계 염료로 개발했다. 그 화학 구조가 확정된 것은 약 9년 뒤였다.

그 기원은 오늘날 이 물질의 명칭에도 남아 있다. "Methylene blue"는 화학적 명칭이 아니라 염료 카탈로그에서 유래한 상품명이다. 이 명칭이 가리키는 화합물은 methylthioninium chloride이며, 누군가 이 물질의 무게를 재거나 규격서를 읽는 순간부터 명칭, 염, 그리고 수화물 사이의 차이가 중요해진다.

염색이 가교 역할을 했다

염료 공장에서 병원으로 이어진 경로는 현미경을 거쳤으며, 그 시작은 메틸렌 블루가 존재하기 전이었다. Wilhelm Erb는 1865년 picric acid를 사용해 혈액에 합성 염료를 적용한 최초의 인물이었고, 일부 적혈구 내부에서 망상형 패턴을 관찰했다.

Paul Ehrlich의 1878년 박사학위 논문은 조직학적 염색을 섬유 염색과 비교하며, 두 과정 모두 화학 반응이라고 주장했다. Robert Koch 아래에서 결핵균을 연구하면서 그는 아닐린 염료를 산성 및 염기성 계열로 분류하고, 각 계열이 세포의 서로 다른 부분을 염색한다는 사실을 확립했다. 1880년 그는 두 계열을 혼합했다. 포화된 메틸렌 블루 용액을 산성 fuchsin에 부어 상등액이 맑아질 때까지 섞었다. 그가 neutralen Farbkörper, 즉 중성 염색이라고 부른 결과물은 한 가지가 아니라 세 가지 색을 만들어냈고, 이전에는 보이지 않던 다형핵세포의 과립을 드러냈으며, 최초의 백혈구 감별계산을 가능하게 했다. 이 과립이 혼합물의 두 성분을 모두 받아들였기 때문에 Ehrlich는 이를 지닌 세포에 neutrophil이라는 용어를 만들었다.

2년 뒤 Koch는 메틸렌 블루를 사용해 결핵균을 찾아냈고, 1883년 Ehrlich는 그 방법을 개선했다. 1886년 그는 다른 종류의 관찰 결과를 발표했다. 살아 있는 동물에 염료를 주입한 뒤 각 장기가 이를 얼마나 강하게 흡수하는지 비교했고, 뇌와 신경 조직에 뚜렷한 친화성이 있다고 결론 내렸다. 그는 이 친화성을 전년도에 관찰했던 염료의 산화-환원 순환에 기인한다고 보았다. 이 순환은 메틸렌 블루 용액이 산소를 소모하면 색을 잃고 공기가 다시 들어오면 색을 되찾는 이유이기도 하다. 그 순환의 결과를 최초로 측정한 실험들은 이후의 다른 시기에 속하며, 그 기전 자체도 역사와는 별개의 주제다.

기생충과 보라색 핵

Alphonse Laveran은 1880년 염색하지 않은 신선한 혈액을 관찰해 말라리아 기생충을 발견했다. 건조 도말 표본에서 이를 일상적으로 관찰하려면 염색이 필요했지만, 당시의 염색법은 빨간색과 파란색만 만들어냈다.

1888년 폴란드 병리학자 Czesław Cheçinski는 acid fuchsin을 eosin으로 대체해 메틸렌 블루와 eosin의 혼합물을 만들었다. 그의 방법의 근거가 된 사례는 30 September 1887에 말라리아로 사망한 병사였다. Cheçinski는 혈액 도말에서 파란색 데이지 모양의 형태를 관찰했는데, 오늘날에는 Plasmodium malariae로 확인되는 것이며, 낫 모양의 형태도 관찰했는데 이는 오늘날 Plasmodium falciparum의 gametocyte로 알려져 있다. 이 결과는 당시 질병을 설명하던 두 가지 경쟁 가설을 동시에 종결시켰다. 하나는 미아스마 이론이었고, 다른 하나는 Edwin Klebs와 Corrado Tommasi-Crudeli가 주장한 말라리아 세균 원인설이었다.

기생충 자체는 보였다. 그러나 핵은 보이지 않았고, 그 때문에 기생충의 본질은 여전히 불확실했다. Breslau의 의사 Ernst Malachowski가 우연히, 그리고 이후에는 의도적으로 이 문제를 해결했다. 그는 1889년 한 표본에서 원충 핵이 차등 염색되는 현상을 발견했지만 재현하지 못했다. 메틸렌 블루를 산성화해도 도움이 되지 않았다. borax로 알칼리화하자 매번 같은 효과가 나타났다. 그는 15 June 1890에 이 기법을 공개적으로 시연했고 같은 해 발표했으며, August 1891에는 더 자세한 방법을 발표했다.

Dmitri Romanowsky는 September 1891에 자신의 방법을 발표했다. 그의 가장 좋은 결과는 2개월 넘게 방치되어 곰팡이가 핀 메틸렌 블루 용액 한 병에서 나왔다. Malachowski의 설명은 의도적으로 개발된 것이었고, 그의 표현대로 쉽게 재현할 수 있었다. Romanowsky의 방법은 한 번 작동했을 뿐 더 이어지지 못한 막다른 길이었다. 그럼에도 그의 이름이 명명에 남았으며, 핵을 보이게 한 보라색 염색을 누가 만들었는지를 둘러싼 논쟁은 자체 문헌을 가진 별도의 이야기다.

그림: Guttmann과 Ehrlich의 1891년 보고서에 실린 두 번째 체온 그래프. 위 패널은 13일부터 24 July까지, 아래 패널은 25 July부터 5 August까지를 다룬다. 여백에는 투여된 용량이 기록되어 있으며, 기록의 마지막 3주 동안 체온은 정상 범위에 가깝게 유지된다. Krafts, Hempelmann 및 Skórska-Stania가 스캔한 보고서에서 재현, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

숙성의 정체는 탈메틸화였다

1890년대에 관여했던 누구도 "숙성"이 메틸렌 블루에 어떤 변화를 일으키는지 알지 못했다. 답은 산업화학에서 나왔다. Heinrich August Bernthsen은 1883년 모체 화합물인 phenothiazine을 합성했고, 1885년 메틸렌 블루가 그 계열에 속한다는 사실을 확립했으며, 같은 시기에 알칼리성 조건이 염료에서 methyl group을 제거해 오늘날 azure라고 부르는 화합물들을 생성한다는 것을 보여주었다.

Bernard Nocht는 1898년과 1899년에 활성 분획을 추출했지만 이를 Rot aus Methylenblau, 즉 메틸렌 블루에서 나온 붉은색이라고만 부를 수 있었다. Michaelis는 1901년에 이를 azure I로 확인했다. Jenner는 1899년 염료 침전물의 용매로 absolute methanol을 도입해 혈액 도말을 가열 고정할 필요를 없앴다. Leishman과 Reuter는 이 두 발전을 결합했고, Wright는 1902년에 단순화된 방법을 발표했다. 역시 1902년에 이루어진 Giemsa의 기여는 무작위로 숙성된 용액에 의존하는 대신, 성분이 알려진 염료를 측정된 양으로 사용하는 것이었다. 이후 그는 순수 methylene azure를 만드는 방법의 공개를 거부하고 그 제조법을 Dr. Grübler의 연구소에 판매했다. 이 연구소는 제품을 azure I로 판매하면서 자사의 제품만이 진짜 Giemsa stain이라고 주장했다.

두 차례의 세계대전은 우연히 이 작업을 마무리했다. 독일산 염료를 구할 수 없게 되자 Lillie, Roe와 Wilcox는 미국산 대체품을 연구했고, 가장 좋은 염색 결과는 분리된 세 가지 성분, 즉 순수 메틸렌 블루, 그 분해산물인 azure B, 그리고 eosin에서 나온다는 사실을 발견했다. 이 세 성분은 오늘날 말라리아 진단에 사용되는 염색법의 주요 구성 성분으로 남아 있으며, 그 명칭에는 이제 Malachowski, Wright와 Giemsa가 함께 연결되어 있다.

그림: Romanowsky형 방법으로 염색한 사람 적혈구 내 Plasmodium falciparum 윤상 형태. 고리 내부의 보라색 구조는 Malachowski가 borax 처리한 메틸렌 블루를 사용해 최초로 보이게 한 chromatin이다. Ernst Hempelmann의 이미지이며 퍼블릭 도메인으로 공개되었다.

하나의 이름, 여러 물질

이 성분들을 구분하기까지 걸린 세월은 화학적 문제가 해결된 뒤에도 남아 있는 문제를 만들었다. Ralph Lillie는 1969년에 생물학적 염료와 비생물학적 염료 사이에 선을 그었다. 전자는 "섬세하고 까다로운 용도에 상응하는 엄격한 규격에 따라 제조"되며, 섬유 착색에 쓰이는 후자는 "덜 엄격하고 까다롭지 않은 제조 기준을 요구"한다고 설명했다. 두 종류의 제품은 같은 이름을 사용했지만, 그 차이는 단순한 정도의 차이가 아니었다. 면직물을 위해 작성된 규격과 진단 시약을 위해 작성된 규격은 서로 대체할 수 없으며, 섬유용 규격에 따라 제조된 물질은 섭취를 목적으로 한 것이 아니었다.

azure B가 이를 가장 분명하게 보여준다. 이는 메틸렌 블루의 monodemethylated 형태이며, 자체적으로 측정 가능한 약리학적 활성이 있고, 두 물질을 분리하기 훨씬 전부터 1세기가 넘는 기간 동안 임상용 메틸렌 블루 제제에 통제되지 않은 성분으로 포함되어 있었다. 한 연구진은 메틸렌 블루 투여 후 부검에서 채취한 사람 조직에 변하지 않은 메틸렌 블루가 5 to 14 per cent, azure B가 86 to 95 per cent 포함되어 있음을 확인했다. 특정 제제에 azure B가 포함되어야 하는지, 그리고 허용 한도가 얼마여야 하는지는 규격의 문제이며, 불순물이자 대사산물로서의 azure B에 관한 연구는 그 지점부터 이어진다.

실질적인 차이 역시 규격에 있다. USP 적합성은 시장에서 제공되는 최고 수준의 순도로 이어지는 기준이다. 단일 측정값이 아니라 완전하게 공개된 시험 표준이기 때문이다. 여기에는 동일성, 함량, azure 염료를 포함한 유기 불순물, 잔류 용매, 원소 불순물, 강열잔분, 미생물 한도 및 세균성 endotoxin이 포함된다. 중금속 결과 하나를 제시하면서 이를 USP 준수라고 부르는 인증서는 이 목록에서 한 항목만 보고한 것이다.

Blupreme은 제약 제조업체로부터 메틸렌 블루를 공급받고 전체 분석 인증서를 공개하며, 중금속만이 아니라 USP 전체 규격을 시험한다. 분석 인증서를 읽는 방법에 대한 가이드와 USP 지정이 입증하는 것과 입증하지 않는 것에서는 문서의 내용이 주장과 일치하는지 확인하는 방법을 다룬다.

역사로부터 말할 수 있는 것과 말할 수 없는 것

그 계보는 실제이며, 대부분의 제품 페이지가 암시하는 것보다 훨씬 길다. 메틸렌 블루는 1891년에 말라리아 치료에 사용되었고, 1899년에는 흥분성 정신병에서 진정제로 사용되었다는 보고가 있었으며, 그 곁사슬의 계보는 quinacrine, chloroquine, promethazine과 chlorpromazine으로 이어진다. Ehrlich가 Arthur Leppmann과 함께 쓴 1890년 논문은 신경통 및 류머티즘성 통증의 완화를 기술했으며, 이후 정신 질환에 이 염료를 시험하는 방안을 검토했지만 시행하지 않기로 했다.

그 어느 것도 현대적 사용을 입증하지 않는다. 1891년의 말라리아 결과는 환자 두 명과 체온 그래프 하나에 불과했다. 어떤 분자에 오랜 사용 역사가 있다는 사실은 연구할 이유이지, 연구 결과 자체가 아니다. 약물로서 이 화합물의 역사와 말라리아에 관한 현대 임상시험은 Ehrlich가 던졌던 질문과는 다른 질문에 답하며, 각 평가변수는 그 자체의 기준으로 읽어야 한다.

기록에는 과거보다 현재에 더 가까운 의미를 갖는 세부 사항이 하나 있다. 연구자들이 2000년대 Burkina Faso에서 메틸렌 블루 말라리아 임상시험을 진행했을 때, pharmaceutical-grade 물질을 확보하기 위해 경쟁해야 했으며, 원료가 GMP 검증을 받자 가격이 약 100배 상승했다고 보고했다. 염료는 대체할 수 있었다. 약물은 그럴 수 없었다. Lillie가 1969년에 그은 구분은 오늘날 한 병 안에 무엇이 들어 있는지를 결정하는 구분과 같다. :::