메틸렌 블루는 어떻게 작동하는가? 산화환원 화학과 작용 기전

실험대 위에 놓인 마개가 있는 플라스크는 메틸렌 블루가 어떻게 작동하는지를 가장 간결하고 정확하게 보여주는 출발점이다. 물, 포도당, 소량의 수산화나트륨, 그리고 액체를 짙고 분명한 파란색으로 만들 만큼의 염료를 넣는다. 몇 분 기다리면 파란색이 빠져나가듯 사라져 플라스크가 물만 담긴 것처럼 보인다. 흔들면 색이 즉시 돌아온다. 그러고는 다시 사라진다. 전자를 내어줄 포도당과 그 전자를 받아들일 산소가 존재하는 한 이 과정은 계속 반복된다.

염료에서 달라진 것은 그것이 가지고 있는 전자의 수뿐이다. 산화된 상태에서는 파란색이고, 환원된 상태에서는 그렇지 않다. 이 분자에 관한 치료 및 연구 문헌의 거의 모든 내용은 이 하나의 가역적 단계에서 출발한다. 한 분자가 한 상대에게서 전자를 받아 다른 상대에게 전달할 수 있다면 그것은 중계체이며, 중계체 자체만으로는 아무 일도 하지 않는다. 무엇을 하는지는 양쪽 끝에 무엇이 있는지에 전적으로 달려 있다.

두 가지 형태, 그리고 이 한 쌍이 중요한 이유

산화형은 평면 구조를 가진 양전하의 고리계다. 이 평평하고 전하를 띤 형태 때문에 핵산에 겹쳐 결합하고, 세포막의 시알산화 구조에 결합하며, 대략 600과 700 nanometres 사이의 가시광선을 강하게 흡수한다. 이 범위는 사람의 눈이 파란색으로 인식하는 스펙트럼 영역이다.

환원형은 성질이 다르다. 전하가 없고, 물보다 지방에 더 잘 녹으며, 무색이다. 체내 pH에서의 이온화 비율은 매우 낮아 수 per cent 수준이다. 따라서 환원된 분자는 확산을 통해 세포막을 쉽게 통과하고, 세포 안으로 들어간 뒤 더 산화적인 환경에서 다시 산화되어 사실상 내부에 갇힐 수 있다. 산화된 고리계는 평평하지만 환원된 형태는 비틀릴 수 있다. 이러한 구조적 결과와 색 변화 자체는 두 형태를 이해하는 데 중요한 부분이며, 메틸렌 블루와 류코메틸렌 블루의 비교에서 더 자세히 다룬다.

전자 받아들이기

산화된 염료는 매우 다양한 전자 공여체로부터 전자를 받아들일 수 있다. 시연용 플라스크에서는 포도당이 그중 하나다. 세포 안에서는 환원된 피리딘 뉴클레오타이드와 미토콘드리아 전자전달계의 구성 요소들이 다른 예다. 산소가 존재하는 조직에서 메틸렌 블루가 환원되면, 그로 인해 형성되는 순환 과정은 환원제와 산소를 모두 소비하고 주로 과산화수소를 포함한 활성산소종을 생성한다. 염료 자체는 변하지 않은 채 순환에서 다시 나오며 같은 과정을 반복할 수 있다.

이 마지막 점은 그렇지 않으면 부주의한 모순처럼 보일 수 있는 문제를 설명한다. 문헌에서는 메틸렌 블루를 산화 촉진제와 항산화제로 모두 설명하며, 두 설명 모두 성립할 수 있다. 메틸렌 블루는 인공 전자 수용체로 작용해 전자의 흐름을 다른 경로로 돌림으로써, 산소가 초과산화물 라디칼로 전환될 효소 부위에서 전자를 빼내 초과산화물 생성을 억제할 수 있다. 간세포 배양에서는 thioredoxin reductase 1과 NADPH quinone oxidoreductase를 포함한 phase-2 항산화 방어 효소를 유도하는 것으로 나타났다. 어느 쪽 성질이 나타나는지는 그 순간 중계 과정의 어느 끝에서 전자가 부족한지에 달려 있다. "메틸렌 블루는 항산화제인가"라는 질문은 어떤 시스템에서, 어떤 농도로, 무엇과 함께 존재하는지를 명시하기 전에는 제대로 구성된 질문이 아니다.

전자 넘겨주기

염료가 여분의 전자를 하나 보유하게 되면 그 다음에는 서로 매우 다른 세 가지 일이 일어날 수 있으며, 이들은 흔히 하나의 제목 아래 함께 설명된다. 그러나 그렇게 묶어서는 안 된다.

금속 중심에 전자를 전달할 수 있다. 가장 명확한 사례는 철(II) 상태에서 철(III) 상태로 산화된 헤모글로빈이다. 이 상태에서는 산소를 운반할 수 없다. 적혈구에서는 효소가 염료를 환원하고, 환원된 염료가 산화된 haem iron에 비효소적으로 전자를 전달해 기능하는 헤모글로빈을 복원한 뒤 염료는 다시 산화형으로 돌아간다. 이 과정에서 염료는 소모되지 않고 순환한다. 이 반응을 기반으로 하는 임상적 상황은 병원에서 다뤄지는 주제이며, 메트헤모글로빈혈증에서 메틸렌 블루에 대한 설명에서는 어떻게 사용되는지와 왜 엄격한 감독이 필요한지를 다룬다.

문헌을 읽을 때 주의할 점이 있다. 이 글의 기반이 된 두 리뷰는 효소 단계에서 동일한 환원 보조인자를 지목하지 않는다. 하나는 NADH라고 하고 다른 하나는 NADPH라고 한다. 이 차이는 실제로 존재하며 여기에서 이용한 자료만으로는 해결되지 않으므로, 하나의 보조인자 이름을 단정하기보다 각 구성 요소가 맡는 역할로 설명하는 편이 안전하다.

빛이 존재하면 산소에 에너지 또는 전자를 전달할 수 있다. 이 경로는 조명이 있을 때만 존재한다. 들뜬 염료는 삼중항 상태에 도달하며, 그 뒤에는 두 가지 기전이 가능하다. 첫 번째에서는 들뜬 염료가 인접한 분자와 직접 상호작용해 수소를 빼앗거나 전자를 전달하고, 그 결과 라디칼이 생성된다. 이런 방식으로 물과 반응하면 hydroxyl radicals이 생성된다. 두 번째에서는 여기 에너지가 산소 자체로 전달되어 singlet oxygen이 생성된다. 이는 매우 친전자성이 강한 종으로 microseconds 이내에 소멸하며, 빛을 받은 메틸렌 블루가 미생물 세포를 손상시키는 주된 경로로 일반적으로 받아들여진다. 세포 외피의 지질 및 펩타이드와의 반응, DNA의 구아닌 염기와의 반응 등이 문서화된 결과에 포함된다.

이 경로가 실무적으로 의미하는 바는 조명 여부에 따라 수치가 몇 자릿수씩 달라질 수 있다는 점이다. Wainwright와 Crossley가 수집한 자료에서 Pseudomonas aeruginosa에 대한 메틸렌 블루의 최소 살균 농도는 어두운 조건에서 around 500 micromolar이고, 12 joules per square centimetre의 광량에서는 around 25 micromolar이다. 한 Staphylococcus aureus 균주에서는 어두운 조건과 조명 조건의 값이 모두 5 micromolar이다. 다시 말해, 이 분자가 항미생물제로 작용하는지 여부조차 분자 자체만의 특성이 아니다. 분자와 빛을 함께 고려해야 하는 특성이다.

중계 과정 없이 효소 부위에 직접 작용할 수 있다. 메틸렌 블루는 nitric oxide synthase에 결합된 ferrous iron을 산화시켜 효소를 비활성화한다. soluble guanylate cyclase를 차단하며, 이를 위해 실험실에서 통상 사용하는 농도는 between 1 and 10 micromolar이다. 또한 monoamine oxidase type A를 between 27 and 180 nanomolar의 IC50으로 억제한다. 이것이 serotonin reuptake inhibitors와의 잘 알려진 상호작용의 기전이며, 메틸렌 블루의 약물 상호작용을 별도의 범주로 다뤄야 하는 이유다.

이 세 경로는 화학적으로 서로 다르다. 이를 모두 메틸렌 블루가 산화환원 순환을 통해 작동한다는 하나의 주장으로 축약하는 것이, 메틸렌 블루에 관한 많은 글이 동시에 확신에 차 있으면서도 모호하게 읽히는 주된 이유다.

기전에 관한 설명이 의미를 가지는지를 결정하는 네 가지 구분

어떤 형태인지. 환원된 염료는 산화된 염료와 서로 바꿔 쓸 수 있는 것이 아니다. Acetylcholinesterase 억제는 이 함정을 잘 보여준다. 장시간의 in vitro 배양에서는 메틸렌 블루가 점차 무색 형태로 환원되고, 그에 따라 억제 효과가 사라진다. 환원된 분자는 해당 효소를 억제하지 않기 때문이다. 형태가 바뀔 만큼 충분히 오래 진행된 분석은 더 약한 효과를 보고하게 되고, 잘못된 설명을 유도할 수 있다.

어떤 농도인지. soluble guanylate cyclase 억제에 사용되는 실험실 범위는 1 to 10 micromolar이다. 쥐 해마 절편에서 glutamate-mediated transmission을 없애는 데에는 5 to 50 micromolar이 필요했다. 세포 배양에서의 독성 효과는 above 100 micromolar에서 보고된다. 이들은 같은 실험이 아니며, 50 micromolar에서 확인된 기전이 혈장 농도가 그 일부에 불과한 사람에게 자동으로 적용되는 것은 아니다.

어떤 경로인지. 절대 경구 생체이용률은 around 72 per cent이고, 말기 혈장 반감기는 5 to 7 hours이다. 경구 투여는 장과 간에서 더 높은 농도를 만들고, 정맥 투여는 뇌에서 더 높은 농도를 만든다. 투여 경로가 어떤 조직이 그 전자를 만나게 되는지를 결정한다.

어떤 모델인지, 그리고 빛이 켜져 있었는지. 기전 연구 문헌의 상당 부분은 세포 배양과 설치류 연구이며, 이 분자에 관한 in vitro 결과는 빛 노출, 막전위, 세포의 산화환원 상태에 따라 달라진다. 현미경 램프만으로도 광감작이 일어날 수 있기 때문이다. 투여된 용량의 Between 65 and 85 per cent는 적혈구와 말초 조직에서 무색 형태로 환원된다. 이 모든 변수는 배양 접시에서 확인된 명확한 기전과 사람에 대한 주장 사이에 놓여 있다.

순도 문제가 곧 화학 문제인 이유

빛을 받으면 메틸렌 블루는 탈메틸화된다. 첫 번째 생성물은 Azure B이고, 그 다음은 Azure A, 이어서 thionin이며, 빛의 세기가 높을수록 낮을 때보다 분해가 더 많이 일어난다. 유용성이 전자를 받아들이고 내어줄 수 있는 능력에 있는 분자라면, 예상되는 분해산물 역시 같은 용액 안에 남아 있는 가까운 화학적 유사체일 가능성이 크다. 따라서 용기 안에 실제로 무엇이 들어 있는지는 외관상의 사소한 문제가 아니다.

이것이 구매자에게 USP 규격 적합 여부가 의미 있는 시험인 이유다. 규격을 충족하지 못하는 제품은 염료에 불과하며, 염료에는 Azure B, 중금속, 잔류 용매를 포함한 불순물이 들어 있을 수 있다. 삼키는 제품이라면 원치 않는 성분들이다. 또 다른 함정은 판매자가 중금속만 검사하고 그 결과를 전체 규격 준수의 증거처럼 제시하는 경우다. Blupreme는 메틸렌 블루의 제약 제조업체와 협력하며 전체 규격을 시험한다. 여기에는 확인 시험, 순도, 유기 불순물, 잔류 용매, 원소 불순물, 강열 잔분, 미생물 한도 및 세균성 엔도톡신이 포함된다. 각 배치의 근거가 되는 시험실 검사 문서가 공개되어 있으며, 공급업체 선택은 대체로 그 문서가 실제로 존재하는지, 그리고 무엇을 검사하는지를 확인하는 문제다.

하나의 가역적 산화환원 쌍. 거기에서 갈라지는 여러 경로. 어떤 주장이 성립할 수 있는지는 그 경로가 결정한다.