메틸렌 블루와 세포 호흡의 관계를 밝혀낸 실험들

탈섬유소 처리한 사람의 혈액을 37 °C에서 세 시간 동안 유지하면 혈액에 포함된 산소의 약 2퍼센트가 소비됩니다. 배양 전에 소량의 메틸렌 블루를 넣으면 같은 혈액이 약 65퍼센트를 소비합니다. 세포 자체는 달라진 것이 없습니다. 달라진 것은 용액뿐입니다.

이 수치는 존스홉킨스의 조지 해롭과 E. S. 구스만 배런이 1928년에 발표한 논문에서 나온 것으로, 메틸렌 블루가 세포 호흡을 개선한다는 널리 반복되는 설명의 출발점입니다. 그 설명은 틀리지 않지만, 실제 의미는 듣는 사람이 생각하는 것보다 좁습니다.

표의 수치가 실제로 측정한 것

측정 지표는 기체 분석으로 확인한 산소 흡수량이었습니다. 해롭과 배런은 갓 채취한 혈액을 10 °C에서 탈지면으로 여과해 백혈구를 제거한 다음, 시료를 산소로 포화시켰습니다. 이를 나누어 한쪽에 염료를 넣고, 배양 후 양쪽을 분석했습니다. 백혈구 수는 세제곱밀리미터당 약 천 개를 넘는 경우가 드물었습니다. 산소 소비량은 시료의 초기 산소 함량 중 사라진 비율로 보고했습니다.

이들은 이산화탄소도 측정했지만, 여기서는 측정 방법에 문제가 있었습니다. 탈섬유소 처리한 혈액은 연구 대상 반응과 무관한 이유로 배양 첫 한 시간 동안 100 mL당 최대 2밀리몰의 이산화탄소를 방출했으므로, 전혈에서 얻은 호흡지수는 사용할 수 없었습니다. 로크 용액에 넣은 세척 세포에서만 해석 가능한 수치를 얻었으며, 염료의 유무와 관계없이 그 값은 0.73에서 0.80 사이에 모여 있었습니다.

이 세부 사항은 사소한 이야기가 아닙니다. 이 논문들에서 말하는 ‘호흡’은 밀폐된 용기 안에서 일어나는 기체 교환을 뜻합니다. 산소 소비와 유용한 에너지 생성 사이의 차이는 산소 소비로 ATP에 대해 알 수 있는 것과 알 수 없는 것에서 따로 살펴봅니다.

호흡이 가장 적은 세포에서 염료의 효과가 가장 컸습니다

성숙한 포유류 적혈구에서는 측정 가능한 산소 소비가 거의 없습니다. 핵이 있는 조류 적혈구에서는 산소 소비가 일어납니다. 해롭과 배런은 두 종류를 모두 실험했고, 이 대비가 그들 주장의 핵심을 이룹니다.

포유류 시료에서 염료는 산소 소비를 스무 배에서 쉰 배까지 증가시켰습니다. 이미 세포가 호흡하고 있던 거위 혈액에서는 증가 폭이 두 배를 넘지 않았습니다. 처음의 호흡량이 클수록 염료가 더할 수 있는 효과는 작았습니다.

같은 종 안에서도 동일한 경향이 나타납니다. 미성숙 세포가 포함된 진성적혈구증가증 환자의 혈액 시료는 염료 없이 산소의 11.3퍼센트를 소비한 반면, 건강한 기증자의 세척 세포는 2.8퍼센트를 소비했습니다. 염료를 넣었을 때 환자 시료의 소비량은 63.4퍼센트까지만 증가했습니다. 정상 세포에서는 거의 서른 배로 빨라졌지만, 이 시료에서는 여섯 배에 그친 것입니다. 염료는 성숙 세포의 양상을 미성숙 세포 쪽으로 바꾸었으며, 저자들도 그렇게 설명했습니다.

시안화물이라면 이를 멈췄어야 합니다

시안화물은 세포의 산화를 멈추는 것으로 알려져 있었습니다. 해롭과 배런은 그런데도 염료와 함께 시안화물을 넣었습니다.

소 혈액에서 얻은 결과가 이를 잘 보여줍니다. 아무것도 넣지 않았을 때 산소 함량은 세 시간 동안 22.61에서 22.03 부피퍼센트로 떨어졌습니다. 메틸렌 블루를 넣으면 12.84로 떨어졌습니다. 메틸렌 블루와 5,000분의 1몰 농도의 시안화칼륨을 함께 넣으면 12.74로 떨어졌습니다. 염료의 효과는 사실상 영향을 받지 않았습니다.

그림: 사람 적혈구의 연속 미세호흡 기록입니다. 화살표는 메틸렌 블루를 넣은 시점을 표시합니다. 그전에는 곡선이 거의 평평하지만, 그 후에는 꾸준히 상승합니다. Harrop and Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478에서 재수록했습니다.

이들은 염료가 산소 운반체로 작용하며, “성체 포유류의 무핵 적혈구에서 사라진 물질을 공급한다”고 결론 내렸습니다. 두 해 뒤, 록펠러 연구소의 미하엘리스와 살로몬은 이 논쟁을 이후에도 이어질 형태로 정리했습니다. 염료의 효과는 “염료의 우연한 특성”이거나, 아니면 염료가 “생물체 안에 있는 어떤 미지의 물질을 보여주는 모델”이라는 것입니다. 이 갈림길은 아직 해소되지 않았습니다. 달라진 점은 이제 세포를 훨씬 더 정확하게 설명할 수 있다는 것입니다.

간 추출물도 같은 작용을 했습니다

미하엘리스와 살로몬은 장기를 찬물로 추출한 추출물도 같은 자극 효과를 낸다는 사실을 보여주었습니다. 쥐의 간이 가장 강했고, 신장, 비장, 고환이 그 뒤를 이었습니다. 뇌, 근육, 혈청은 효과가 거의 없거나 전혀 없었습니다.

이들은 이어서 일산화탄소가 추출물의 작용에 미치는 영향을 시험했습니다. 추출물이나 염료로 유도된 호흡은 일산화탄소 98퍼센트와 산소 2퍼센트의 혼합 기체에서도 변하지 않았습니다. 같은 혼합 기체는 효모와 핵이 있는 닭 적혈구의 호흡을 약 60에서 80퍼센트 억제했으며, 이는 일산화탄소에 민감한 호흡 효소에 관한 바르부르크의 설명과 일치했습니다. 따라서 정체가 밝혀지지 않은 이 조직 물질은 바르부르크의 효소가 아니었습니다.

그 과정에서 몇 가지 후보 물질이 배제되었습니다. 환원형 글루타티온과 시스테인은 자기 자신의 산화에 필요한 만큼의 산소 소비만 일으켰습니다. 하든과 영의 조효소는 근육에 가장 많이 들어 있는데도 근육의 효과가 거의 가장 작았기 때문에 배제되었습니다. 몇 년 전에 명명된 케일린의 시토크롬도 같은 모순에 부딪혔습니다. 활성 물질이 세포핵에서 나온다는 자신들의 제안에 대해서도, 이들은 단지 하나의 제안일 뿐이라고 밝혔습니다.

효과가 나타나려면 조건이 필요했습니다

세포는 온전해야 했습니다. 증류수나 반복적인 동결로 용혈을 일으키면 염료와 추출물에 대한 반응이 모두 사라졌고, 부분적인 용혈은 그 정도에 비례해 반응을 줄였습니다.

당도 필요했습니다. 포도당, 과당, 자당은 염료가 유도하는 호흡을 뒷받침했지만, 만니톨은 그렇지 못했습니다. 당이 없으면 호흡이 전혀 일어나지 않았고, 그 과정에서 염료가 세포를 손상시키는 것으로 보였습니다. 그래서 한두 시간 뒤에 포도당을 넣어도 호흡은 회복되지 않았습니다. 저자들은 염료가 세포에 필요한 구조적 성분을 산화시키는 것이라고 추정했습니다.

빛을 비추면 염료의 효과가 상당히 커졌지만, 어둠 속에서도 효과는 분명했습니다. 다른 환원 가능한 염료들은 서로 다르게 작용했습니다. 톨루일렌 블루는 메틸렌 블루와 같거나 더 큰 효과를 보였지만, 인디고 디설포네이트는 거의 아무 효과가 없었습니다. 염료의 산화환원 전위와 효과의 크기 사이에는 뚜렷한 관계가 나타나지 않았으며, 저자들은 이를 막 투과성과 독성 때문이라고 보았습니다.

효과는 호흡이 아니라 발효와 연관되었습니다

배런의 1930년 연구는 세포 현탁액에서 벗어나 정상 쥐 장기와 이식 종양의 조직 절편을 대상으로 했습니다.

호기성 해당작용이 없는 조직에서 메틸렌 블루는 아무 효과가 없거나 산소 소비를 약간 억제했습니다. 신장에서는 약 14퍼센트, 췌장에서는 약 14퍼센트, 간에서는 약 5퍼센트 감소했습니다. 산소가 있는 상태에서도 발효하는 조직에서는 소비량을 늘렸습니다. 비장에서는 약 8퍼센트, 뇌에서는 약 13퍼센트 증가했습니다. 종양에서의 증가 폭은 사람 유방암종의 약 27퍼센트부터 라우스 닭 육종의 80퍼센트 이상까지였으며, 대체로 각 조직의 호기성 해당작용에 비례했습니다.

그림: 각 점은 하나의 조직 유형을 나타냅니다. 가로축은 호기성 해당작용이며, 세로축은 메틸렌 블루를 넣은 뒤의 산소 소비 변화입니다. 자료 출처는 Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), 표 6, PMID 19869777입니다.

이어서 시안화물 실험에서는 정반대의 양상이 나타났습니다. 이전에는 반응하지 않던 조직의 호흡을 시안화물로 차단해 발효가 드러나자, 염료는 다시 산소 소비를 늘렸습니다. 신장에서는 약 59퍼센트, 간에서는 약 19퍼센트, 비장에서는 약 286퍼센트, 고환에서는 약 200퍼센트 증가했습니다.

배런은 염료가 세포나 조직의 발효 능력을 시험하는 수단이 될 수 있다고 제안했고, 하나의 추측으로 논문을 마무리했습니다. 염료를 포함한 배지에서 종양을 여러 세대에 걸쳐 배양하면 언젠가는 종양의 대사가 정상 조직처럼 영구적으로 바뀔 수도 있다는 것입니다. 이는 1930년에 제시된 연구 질문이지, 치료 효과에 대한 주장이 아닙니다.

이 실험들이 측정할 수 없었던 것

1928년과 1930년에 ‘호흡’은 산소 소비를 뜻했습니다. 아데노신 삼인산은 1929년에 처음 보고되었으며, 분리한 미토콘드리아가 전자를 전달하면서 인산을 에스테르화한다는 사실은 1949년에 입증되었습니다. 초기 메틸렌 블루 논문들은 어느 것도 에너지 생성을 측정할 수 없었으며, 그렇게 했다고 주장하지도 않았습니다.

두 번째 문제는 세포입니다. 성숙한 포유류 적혈구에는 미토콘드리아가 없습니다. 망상적혈구 단계에서 선택적 자가포식으로 미토콘드리아와 리보솜을 제거하기 때문입니다. 따라서 성숙 적혈구는 해당작용으로 에너지를 얻고, 오탄당 인산 경로에는 ATP보다 주로 NADPH를 얻기 위해 의존합니다. 1928년 실험에는 복구할 전자전달계 자체가 없었습니다. 산소를 소비한 것은 무엇이든 다른 일을 하고 있었던 것입니다.

그 다른 일이 무엇인지는 이제 상당히 잘 설명되어 있습니다. 메틸렌 블루는 세포의 환원 당량에서 전자를 받아 류코메틸렌 블루가 되고, 이것이 분자 산소에 의해 다시 산화되면서 순환이 완성됩니다. 사람 적혈구에서는 NADPH 의존성 플라빈 환원효소와 관련 이황화물 환원효소들이 환원 단계를 수행합니다. 표지된 포도당을 사용한 1976년 연구에서는 염료가 헥소스 일인산 우회로를 자극하고, 낮은 농도에서의 효과는 산소헤모글로빈에 의존하며, 더 높은 농도인 0.1 mM에서는 과산화수소가 생성된다는 사실을 발견했습니다. 환원된 염료가 산소와 만나면 생성되는 것은 인산 결합이 아니라 과산화물입니다.

미토콘드리아에서의 작용은 대중적인 요약에서 인정하는 것보다 논쟁이 더 많습니다. 한 연구 흐름은 염료가 복합체 I 부근에서 전자를 받아 시토크롬 c로 전달한다고 봅니다. 다른 연구는 생쥐 뇌 미토콘드리아에서 안티마이신으로 차단한 뒤에는 염료가 호흡을 회복시키지 못한다는 사실을 발견했고, 전자 수용 위치를 복합체 III의 유비퀴놀 결합 부위로 보았습니다. 또 다른 연구에서는 낮은 농도가 휴지 상태의 산소 소비를 높이면서도 ADP로 자극한 호흡은 변화시키지 않는다는 사실을 발견했습니다. 이 요점을 가장 직접적으로 보여주는 것은 메틸렌 블루가 유도하는 산소 소비가 산화적 인산화에 전혀 의존하지 않는다는 점입니다. 호흡 사슬을 억제했을 때도, 호흡 사슬이 없는 실험 표본에서도 산소 소비는 계속되었습니다.

두 양 사이의 차이를 직접 측정한 결과도 있습니다. 분리한 쥐 간 미토콘드리아에서는 염료 농도를 높일수록 호흡 조절비가 낮아지고 팽윤이 일어났으며, 저자들은 이를 산화적 인산화의 탈결합으로 설명했습니다. 관류한 쥐 간에서는 메틸렌 블루가 산소 소비를 높이는 동안 ATP 대 ADP 비율은 떨어졌습니다.

임상 기록도 같은 메시지를 전합니다. 메트헤모글로빈혈증은 NADPH 의존성 환원 경로를 통해 체중 1킬로그램당 약 1에서 2밀리그램의 메틸렌 블루를 정맥으로 투여하여 치료하며, 더 많은 용량은 치료하려는 그 상태를 일으킵니다. 같은 종설에서는 해독 효과가 온전한 적혈구에서 가장 크고 용혈이 있으면 줄어든다고 설명합니다. 이는 1930년의 용혈 관찰 결과가 73년 뒤 병원 환경에서 다시 나타난 것입니다. 유용한 효과와 해로운 효과가 용량의 경계값 양쪽에 놓여 있는 화합물의 용량을 산소 소비 측정값으로 추론해서는 안 됩니다.

이 논의에 제조 배치가 포함되어야 하는 이유

해롭과 배런은 다시 읽어볼 만한 사실을 발견했습니다. 메틸렌 블루 자체가 분광기에서 메트헤모글로빈의 두 특징적인 띠 사이에 하나의 띠를 만들며, “대충 살펴보면 쉽게 혼동을 일으킬 수 있다”는 것입니다. 염료가 검출하려는 물질처럼 보일 수 있습니다.

같은 문제는 화학적 형태로도 나타납니다. 미량 성분으로 존재하는 관련 페노티아진은 고유한 산화환원 특성, 투과성, 독성을 지닙니다. 기록된 한 사례는 이 문제가 왜 중요한지 구체적으로 보여줍니다. 메틸렌 블루의 아이오딘화 연구에서 약 7에서 8퍼센트의 Azure B를 포함한 시료는 주로 아이오딘화된 Azure B를 생성했습니다. 즉, 반응을 지배한 것은 메틸렌 블루가 아니라 불순물이었습니다.

실험실, 염색 작업대, 수족관 어디에서든 메틸렌 블루를 시약으로 사용하는 사람은 해당 배치의 특성이 확인되지 않았다면 정체가 명확히 규정되지 않은 성분을 다루고 있는 셈입니다. 유연물질, 확인시험, 원소 불순물, 잔류 용매, 강열잔분은 실험 주변의 서류 작업이 아니라 실험의 일부입니다. Blupreme은 제약 제조업체에서 메틸렌 블루를 공급받고, 중금속만이 아니라 USP 규격 전체를 시험한 완전한 시험성적서를 공개합니다. 시험성적서 읽는 방법과 USP 등급 표기가 입증하는 것과 입증하지 않는 것에서는 문서가 해당 주장에 부합하는지 확인하는 방법을 다룹니다.

수치는 맞았습니다

1928년과 1930년의 실험은 신중하게 수행되었으며, 그 핵심 관찰은 지금까지 유효합니다. 환원 가능한 염료는 거의 호흡하지 않는 세포가 휴지 상태보다 여러 배 많은 산소를 소비하게 할 수 있으며, 그 과정은 시안화물이 차단하는 단계를 거치지 않습니다.

오류는 나중에 ‘호흡’을 현대적 의미로 읽을 때 생깁니다. 기체 교환 측정은 전자가 산소에 도달했다는 사실을 알려줍니다. 그 전자 중 어느 것이든 ATP를 만드는 데 사용되었는지는 알려주지 않으며, 미토콘드리아가 없는 세포에서는 이 두 설명 사이의 간극이 더없이 큽니다. 메틸렌 블루가 세포에서 하는 일을 더 넓게 살펴보는 작용 지도는 같은 구분을 더 넓은 맥락에서 다루며, 염료에서 의약품으로 이어진 이 화합물의 역사는 섬유 착색제가 애초에 어떻게 이 실험들에 등장하게 되었는지 설명합니다.