記事
メチレンブルーの歴史：染料から医薬品、そして研究へ
メチレンブルーが薬局に並ぶより先に、それを投与された患者がいました。
Paul GuttmannとPaul Ehrlichが1891年に発表した、マラリアに対するこの染料の使用報告には、2つの体温表が掲載されています。2つ目は13 Julyから5 Augustまでを記録しており、各日の治療内容が欄外に書き込まれています。18 Julyと19 Julyの記載は「1 × 0,05 Methylenblau」です。その後の日には同量を5回、7回投与したことが記され、22 Julyまでには少量のキニーネも記録に加わっています。表の前半で37 °Cから39.5 °Cの間を上下していた発熱曲線は、染料の投与開始後に平坦化し、残りの3週間はおよそ36 °Cから37.5 °Cの間にとどまっています。
患者は2人のうちの1人で、論文では家事使用人と船員として記載されています。彼らが投与された化合物は、その時点ですでに15年間、市販の繊維染料として使われていました。この2人は、特定の生物を標的として完全合成された薬物による治療を受けたことが記録されている、最初期の人々に含まれます。
最初にあったのは染料
商業的に成功した最初の合成染料は、William Henry Perkinによって1856年に作られました。Perkinは18歳で、復活祭休暇中に自宅の実験室でキニーネの合成を試みていました。しかし得られたのは黒い残留物でした。それを溶かしてみると、絹に鮮やかに定着する色素であることが分かりました。彼は1856年8月に特許を取得し、1857年末までにはロンドンの絹染色工場へ供給する工場を持っていました。
1875年、Adolf von Baeyerは赤色染料を合成し、夜明けを意味するギリシャ語Eosにちなんでeosinと名付けました。1876年には、当時Badische Anilin- und Soda-Fabrikの研究所長だったHeinrich Caroが、Baeyerとともにメチレンブルーを綿用のアニリン系染料として開発しました。その化学構造が確定したのは、およそ9年後です。
その起源は、現在の物質名にも残っています。「Methylene blue」は化学的な記述ではなく、染料カタログに由来する商品名です。この名称が指す化合物はmethylthioninium chlorideであり、材料を秤量したり仕様書を読んだりする段階になると、名称、塩、そしてその水和物の違いが重要になります。
染色が橋渡しとなった
染料工場から病院へ至る道は顕微鏡を経由しました。そしてその始まりは、メチレンブルーが存在する以前にさかのぼります。Wilhelm Erbは1865年、picric acidを使って血液に合成染料を適用した最初の人物で、一部の赤血球の内部に網状の模様を観察しました。
Paul Ehrlichの1878年の博士論文は、組織学的染色と繊維染色を比較し、どちらも化学反応であると論じました。Robert Kochのもとで結核菌を研究していたEhrlichは、アニリン染料を酸性色素と塩基性色素に分類し、それぞれが細胞の異なる部分を染めることを明らかにしました。1880年、彼はこの2種類を混合しました。上清が透明になるまで、飽和メチレンブルー溶液をacid fuchsinに加えたのです。彼がneutralen Farbkörper、すなわち中性色素と呼んだその混合物は、1色ではなく3色を生じ、それまで見えなかった多形核細胞内の顆粒を可視化し、初めて白血球分画の算定を可能にしました。その顆粒が混合物の両成分を取り込んだことから、Ehrlichはそれを持つ細胞にneutrophilという名称を付けました。
2年後、Kochは結核菌を見つけるためにメチレンブルーを使用し、1883年にはEhrlichがその方法を改良しました。1886年、Ehrlichは別種の観察結果を発表しました。生きた動物に染料を注射し、それぞれの臓器がどの程度強く取り込むかを比較した結果、脳および神経組織に顕著な親和性があると結論づけたのです。彼はこの親和性を、その前年に観察していた染料の酸化還元サイクルに帰しました。このサイクルは、メチレンブルー溶液の酸素が消費されると色が消え、再び空気に触れると色が戻る理由でもあります。そのサイクルの影響を初めて測定した実験は後の年代に属するものであり、その機構自体も歴史とは別の主題です。
寄生虫と紫色の核
Alphonse Laveranは1880年、新鮮な無染色血液を観察してマラリア原虫を発見しました。しかし乾燥血液塗抹標本で日常的に観察するには染色が必要で、当時の染色法で得られる色は赤と青だけでした。
1888年、ポーランドの病理学者Czesław Cheçinskiはacid fuchsinをeosinに置き換え、メチレンブルーとeosinの混合液を作りました。彼の方法の背景にあった症例は、30 September 1887にマラリアで死亡した兵士でした。血液塗抹標本の中でCheçinskiは青いヒナギク状の形態を観察しました。これは現在ではPlasmodium malariaeと認識されています。また鎌状の形態も観察し、これは現在ではPlasmodium falciparumの生殖母体と認識されています。この結果によって、当時競合していた2つの病因説が同時に退けられました。瘴気説と、マラリアは細菌によって引き起こされるとするEdwin KlebsおよびCorrado Tommasi-Crudeliの主張です。
寄生虫は見えるようになりました。しかしその核は見えず、その正体についてはまだ不明な点が残りました。Breslauの医師Ernst Malachowskiは、偶然その問題を解き、その後は意図的に再現しました。1889年、彼は標本の中でマラリア原虫の核が異なる色に染まっていることに気づきましたが、再現できませんでした。メチレンブルーを酸性化しても効果はありませんでした。boraxでアルカリ性にすると、毎回その効果が得られました。彼は15 June 1890にこの技法を公開実演し、同年に発表、さらにAugust 1891にはより詳しい方法を公表しました。
Dmitri RomanowskyはSeptember 1891に自身の方法を発表しました。最良の結果が得られたのは、2か月以上放置され、カビの生えたメチレンブルー溶液の瓶でした。Malachowskiの記述は意図的な方法であり、本人の言葉では容易に再現できるものでした。一方、Romanowskyの方法は一度うまくいっただけで、その先につながるものではありませんでした。それでも、その名はRomanowskyに残りました。核を可視化した紫色を誰が生み出したのかをめぐる論争は、独自の文献を持つ別の物語です。
図： GuttmannとEhrlichによる1891年の報告に掲載された2つ目の体温表。上段は13から24 July、下段は25 Julyから5 Augustを示しています。欄外には投与量が記載され、記録の最後の3週間は体温がおおむね正常域にとどまっています。Krafts, Hempelmann and Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012)のためにスキャンされた報告書から転載。PMID 22411634。
熟成の正体は脱メチル化だった
1890年代に関わっていた人々は、「熟成」がメチレンブルーに何をしているのかを知りませんでした。その答えは工業化学から得られました。Heinrich August Bernthsenは1883年に母体化合物phenothiazineを合成し、1885年にはメチレンブルーがその化合物群に属することを明らかにしました。また同じ時期に、アルカリ条件では染料からメチル基が外れ、現在azuresと呼ばれる化合物が生成することも示しました。
Bernard Nochtは1898年と1899年に活性画分を抽出しましたが、それをRot aus Methylenblau、すなわちメチレンブルーから得られる赤色物質と呼ぶことしかできませんでした。Michaelisは1901年、それをazure Iと同定しました。Jennerは1899年、染料沈殿物の溶媒としてabsolute methanolを導入し、血液塗抹標本を加熱固定する必要をなくしました。LeishmanとReuterはこの2つの進歩を組み合わせ、Wrightは1902年に簡略化した方法を発表しました。同じく1902年のGiemsaの貢献は、偶然に熟成した溶液へ依存することをやめ、既知の染料を測定した量で使用することでした。その後、彼は純粋なmethylene azureの製法を公表せず、その方法をDr. Grübler's laboratoryに売却しました。同研究所は製品をazure Iとして販売し、自社版だけが真正なGiemsa stainであると主張しました。
2度の世界大戦が、偶然その作業を完成させました。ドイツ製染料が入手できなくなると、Lillie、Roe、Wilcoxは米国製の代替品を研究し、最良の染色が3つの分離された成分から得られることを発見しました。純粋なメチレンブルー、その分解生成物であるazure B、そしてeosinです。この3つは現在でもマラリア診断に使用される染色法の主要成分であり、その名称には現在、Malachowski、Wright、Giemsaが併記されています。
図： Romanowsky型の方法で染色した、ヒト赤血球内のPlasmodium falciparumリング状形態。リング内部の紫色構造はchromatinであり、Malachowskiがborax処理したメチレンブルーによって初めて可視化されたものです。画像はErnst Hempelmannによるもので、パブリックドメインとして公開されています。
1つの名称、複数の材料
これらの成分が区別されるまでに長い年月を要したことで、化学そのものより長く残る問題が生じました。Ralph Lillieは1969年、生物学用染色剤と非生物学用染料の境界を明確にしました。前者は「繊細かつ厳密な用途に見合う厳格な仕様に従って製造される」ものであり、繊維着色用の後者は「それほど厳格で要求の高い製造基準を必要としない」としました。どちらの製品にも同じ名称が付いていましたが、その違いは単なる程度の差ではありませんでした。綿用に作られた仕様と診断試薬用に作られた仕様には互換性がなく、繊維用仕様で製造された材料は、摂取することを意図したものではありません。
Azure Bは、この点を最も明確に示す例です。これはメチレンブルーが1つ脱メチル化された形態で、それ自体に測定可能な薬理活性があり、両者が分離されるまで1世紀以上にわたり、臨床用メチレンブルー製剤に管理されていない成分として含まれていました。ある研究グループは、メチレンブルー投与後の剖検で採取されたヒト組織に、未変化のメチレンブルーが5 to 14 per cent、azure Bが86 to 95 per cent含まれていたと報告しました。特定の製剤にazure Bを含めるべきか、またその上限をどこに設定するかは仕様の問題であり、不純物および代謝物としてのazure Bに関する研究はそこから先を扱っています。
実際上の重要点も仕様にあります。USPへの適合は、市場で提供される最高純度へ至るための基準です。それは単一の測定値ではなく、公表された完全な試験規格だからです。そこには同一性、含量、azure色素を含む有機不純物、残留溶媒、元素不純物、強熱残分、微生物限度、細菌エンドトキシンが含まれます。重金属の結果を1項目だけ報告してUSP適合と称する証明書は、その一覧のうち1行しか報告していません。
Blupremeは医薬品メーカーからメチレンブルーを調達し、完全な分析証明書を公開しています。重金属だけではなく、USP仕様全体を試験しています。分析証明書の読み方のガイドと、USPという表示が何を証明し、何を証明しないのかでは、文書と主張を照合する方法を説明しています。
歴史から言えること、言えないこと
その系譜は事実であり、多くの商品ページが示唆するよりも長いものです。メチレンブルーは1891年にマラリア治療に使用され、1899年には興奮を伴う精神病に対する鎮静薬として報告されました。また、その側鎖化学はquinacrine、chloroquine、promethazine、chlorpromazineへとつながっています。EhrlichがArthur Leppmannと1890年に発表した論文では、神経痛およびリウマチ性疼痛の軽減が記述され、その後、精神疾患で染料を試験する可能性を検討したものの、実施は見送られました。
そのいずれも、現代における使用を確立するものではありません。1891年のマラリアに関する結果は、2人の患者と1つの体温表によるものでした。ある分子が長く知られていることは研究する理由にはなりますが、それ自体が結果ではありません。薬物としてのこの化合物の歴史と現代のマラリア臨床試験が答えるのは、Ehrlichが問うていたものとは異なる問題であり、それぞれの評価項目は独自の条件に即して読む必要があります。
記録の中には、過去ではなく現在につながる細部が1つあります。2000年代にBurkina Fasoで研究者がメチレンブルーのマラリア試験を行った際、医薬品グレードの材料をめぐって競争する状況となり、原料価格はGMP validationを得ると約100倍に上昇したと報告されました。染料なら代替できました。薬物は代替できませんでした。Lillieが1969年に示した区別は、今日のボトルの中身を決める区別と同じものです。 :::