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Colorazione con blu di metilene: metodi di microscopia e atlante di immagini reali
La colorazione con blu di metilene rende più facili da distinguere, nella microscopia in campo chiaro, caratteristiche cellulari altrimenti poco visibili. Può aiutare gli studenti a individuare il nucleo di una cellula della mucosa della guancia o a esaminare il contorno e la disposizione dei microrganismi. Un oggetto blu, tuttavia, è un'osservazione. Dare un nome all'organismo, misurarlo e stabilire se indichi una malattia sono attività distinte.
L'immagine di copertina illustra il principio del contrasto. L'atlante seguente contiene fotografie reali di campioni documentati in modo indipendente, con le informazioni sulle fonti originali.
Che cosa rivela il blu di metilene?
Il blu di metilene è un colorante basico: il suo ione colorato ha una carica positiva. Come spiega OpenStax nella trattazione della colorazione dei campioni, i coloranti basici interagiscono con il materiale cellulare carico negativamente e possono far risaltare le cellule su uno sfondo più chiaro. Nei preparati appropriati, il blu di metilene evidenzia le regioni ricche di acidi nucleici e altre strutture che legano il colorante.
In una colorazione semplice, il contrasto è fornito da un solo colorante. Di conseguenza, organismi diversi possono apparire blu senza essere lo stesso organismo. Le domande utili sono inizialmente descrittive: gli oggetti sono rotondi o allungati, isolati o raggruppati, colorati in modo uniforme o differenziati al loro interno? Consulta la distinzione tra colorazione semplice e colorazione di Gram prima di interpretare il colore come risultato di una classificazione.
Contrasto e risoluzione sono diversi. Il contrasto aiuta a distinguere un oggetto da ciò che lo circonda; la risoluzione permette di separare dettagli vicini. Un'immagine più scura non garantisce un maggior numero di strutture risolte. Né ogni granulo scuro merita di essere identificato come un organello.
Preparati nativi, preparati a fresco colorati e strisci
Un preparato a fresco non colorato, o nativo, permette un'osservazione senza aggiunta di colorante, anche se la rimozione dall'ambiente originale modifica comunque il campione. In un preparato a fresco colorato si aggiunge il reagente mentre il materiale rimane in un liquido sotto un coprioggetto. Uno striscio fissato distribuisce il materiale su un vetrino e prevede un metodo di fissazione specificato prima dei trattamenti successivi. La panoramica di OpenStax sulla preparazione dei campioni distingue i preparati a fresco dalla fissazione e spiega perché gli organismi fissati non consentano più di osservarne il movimento o il metabolismo normali.
Questi preparati rispondono a domande diverse:
| Preparato | Osservazione utile | Che cosa l'immagine, da sola, non può stabilire |
|---|---|---|
| Preparato a fresco nativo | Movimento, contorni, materiale naturalmente visibile | Identità basata soltanto sul movimento o sulla forma |
| Preparato a fresco colorato | Contrasto tra le strutture che legano il colorante e ciò che le circonda | Se il reagente abbia lasciato inalterata la normale fisiologia |
| Striscio fissato e colorato | Morfologia conservata dopo una preparazione definita | Come si comportava il campione vivo originale |
| Metodo differenziale specifico | Una reazione di colorazione definita con controlli appropriati | Identità della specie o diagnosi senza l'insieme delle ulteriori evidenze richieste dal metodo |
Per un confronto in classe, documenta un preparato non colorato prima di esaminarne uno colorato separatamente, realizzato secondo il protocollo didattico. Mantieni comparabili l'illuminazione e le impostazioni di acquisizione delle immagini. Se vengono fotografate due cellule diverse, descrivile come esempi, non come una documentazione della stessa cellula prima e dopo la colorazione.
Atlante di microscopia: tre campioni reali colorati
Questo atlante è una selezione e un'interpretazione originali di tre micrografie distribuite con licenze aperte. Gli autori delle fonti identificano i campioni e i coloranti. Non abbiamo verificato in modo indipendente l'autenticità dei loro campioni. Le immagini sono riprodotte senza ritagli come conversioni WebP senza perdita di dati, senza aggiunta di elementi o modifiche dei colori.
Tavola 1: cellule della mucosa della guancia umana
Campione: cellule della mucosa della guancia umana. Colorante: blu di metilene. Ingrandimento: 400×, dichiarato dal fotografo. Barra di scala: non disponibile; la fonte non fornisce una dimensione calibrata dei pixel. Fotografia di Fritzmann2002, 2017, da Cellule della mucosa della guancia umana (colorazione con blu di metilene), distribuita con licenza CC BY-SA 4.0. Questa riproduzione mantiene la stessa licenza.
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Inizia da una cellula isolata: il suo nucleo più scuro è più facile da distinguere dal citoplasma blu circostante. Poi esamina le cellule sovrapposte sotto di essa. La sovrapposizione rende più difficile seguire un contorno e può creare una regione localmente più scura. Usa questa tavola per esercitarti a seguire i contorni, non per contare ogni macchia scura come un nucleo. La guida all'osservazione delle cellule della mucosa della guancia approfondisce l'esercizio specifico per questo campione.
Tavola 2: cellule di cipolla
Campione: cellule di cipolla, secondo l'identificazione della fonte. Colorante: blu di metilene. Ingrandimento: “200x” compare nel nome del file originale; non è stato verificato in modo indipendente. Barra di scala: non disponibile; non viene fornita alcuna calibrazione. Fotografia di Alvy16, 2019, da Cellula di cipolla 200x, distribuita con licenza CC BY 4.0.
I compartimenti allungati formano uno strato organizzato. Confronta i loro lunghi confini condivisi con i contorni irregolari della Tavola 1. Nota anche il materiale scuro ben evidente e la luminosità non uniforme del campo. La fotografia non stabilisce l'identità di ogni deposito scuro. Mostra perché una documentazione utile delle osservazioni includa artefatti e incertezze, invece di assegnare un'identità a tutto ciò che assorbe il colorante.
Tavola 3: lievito identificato dalla fonte come Candida spp.
Campione: Candida spp., secondo la fotografa. Colorazione: colorazione positiva semplice con blu di metilene. Ingrandimento: non disponibile. Barra di scala: non disponibile; non viene fornita una dimensione calibrata dei pixel. Fotografia di Marta, utente Wikimedia Martunia.g, 2021, da Colorazione positiva con blu di metilene 2, distribuita con licenza CC BY 4.0.
Confronta i densi raggruppamenti blu con i margini meno affollati. I singoli contorni sono più facili da seguire dove gli oggetti si sovrappongono meno. Il nome Candida proviene dalla documentazione della fonte, non da un'identificazione della specie effettuata su questa fotografia. Questa tavola non fornisce neppure un risultato sulla vitalità. I saggi di vitalità e respirazione del lievito richiedono condizioni, controlli e interpretazioni propri.
Leggere correttamente la scala
Queste tavole consentono un confronto visivo, non misurazioni in micrometri o confronti delle dimensioni cellulari assolute tra le tavole. L'ingrandimento dichiarato non permette di ricostruire la calibrazione mancante della fotocamera. Modificare le dimensioni di visualizzazione di un'immagine ne cambia l'ingrandimento apparente.
Per le tue immagini, stabilisci una calibrazione delle misure usando uno standard noto e la configurazione ottica pertinente. La guida di Nikon alla micrometria spiega come un micrometro da tavolino permetta di convertire le divisioni arbitrarie di un'immagine o di un reticolo in lunghezze fisiche. Registra l'obiettivo, la configurazione della fotocamera e la calibrazione, quindi aggiungi una barra di scala ricavata da questi dati. Non ricavare una barra di scala dalle dimensioni cellulari medie riportate in un manuale.
Il flacone è adatto al metodo?
Un flacone etichettato come blu di metilene non costituisce una specifica di laboratorio completa. Controlla la concentrazione e le unità, il solvente, gli ingredienti aggiuntivi, l'applicazione prevista, la documentazione del lotto e le istruzioni. La scheda di dati di sicurezza di un reagente ne descrive i pericoli; le istruzioni del metodo stabiliscono come usarlo per il preparato previsto.
Un esempio concreto è la soluzione di blu di metilene di Löffler di Merck. Il produttore la identifica come reagente per microscopia e ne descrive il ruolo di colorante di contrasto nella colorazione per l'acido-resistenza. Anche l'infiammabilità indicata mostra perché “un liquido blu” non sia un'informazione sufficiente per pianificarne la manipolazione o il riscaldamento. Queste proprietà si applicano a quella formulazione, non automaticamente a ogni soluzione acquosa di blu di metilene.
Analogamente, l'agar eosina-blu di metilene è un terreno di coltura formulato. Non è un colorante per vetrini ottenuto aggiungendo semplice blu di metilene a un campione. Per un diverso obiettivo di osservazione, confronta le alternative al blu di metilene per la microscopia.
Per un kit da microscopia per principianti, parti dal metodo didattico documentato, da vetrini preparati di contenuto noto e dal reagente specificato. Se un flacone ha perso l'etichetta o non è possibile determinarne la composizione, sostituiscilo con il reagente appropriato e documentato. Usa protezioni per gli occhi e segui le istruzioni di manipolazione fornite per la formulazione effettiva. Il materiale umano e i campioni ambientali sconosciuti richiedono le procedure di manipolazione e smaltimento dei campioni del laboratorio didattico; la colorazione non sostituisce tali procedure.
Scrivi l'osservazione prima della conclusione
“Oggetti ovali blu raggruppati” è una descrizione sostenibile di un'immagine. “Una particolare infezione” richiede evidenze che l'immagine non ha fornito. Nel quaderno di laboratorio, tieni separate la provenienza del campione, la preparazione, la reazione di colorazione e il metodo di identificazione. Questa distinzione rende utile una semplice immagine didattica e impedisce che una micrografia accattivante venga usata per sostenere un'affermazione che non può supportare.