Come il blu di metilene entra nelle cellule: riduzione, riossidazione e ripartizione nella membrana

Osservando una coltura di cellule endoteliali che captano il blu di metilene, l'interpretazione più ovvia è anche quella sbagliata. Il terreno perde il suo colore blu, le cellule si riempiono di granuli blu, quindi il colorante deve aver attraversato la membrana sotto forma di molecola blu. Gli esperimenti dicono il contrario. La forma blu attraversa la membrana solo in minima misura. A passare è la forma incolore, e il blu che si vede all'interno si forma proprio lì, dopo l'ingresso.

Questo capovolgimento è importante perché determina che cosa la colorazione può e non può rivelare. I granuli blu indicano la presenza di colorante ossidato, riossidato e intrappolato negli organelli. Non indicano la quantità totale di colorante nella cellula, non rivelano la frazione ridotta e non misurano l'effetto biologico. Per capire perché, seguiamo le tre fasi: riduzione sulla superficie, diffusione della forma ridotta, riossidazione e intrappolamento all'interno.

Le due forme si comportano come molecole diverse

Il blu di metilene ossidato è un sistema di anelli planare con carica positiva. Si scioglie in acqua, assorbe intensamente la luce intorno a 600–700 nanometri e appare blu. Il punto centrale è la carica. Una molecola carica e idrofila non attraversa facilmente una membrana lipidica, perciò la formulazione prudente usata in letteratura è relativamente impermeante alla membrana, non impermeante.

Il blu di metilene ridotto, chiamato leucometilene blu, è incolore, privo di carica e liposolubile. Eliminata la carica, la membrana smette di essere una barriera. La molecola ridotta la attraversa facilmente per diffusione e, una volta entrata in un compartimento più ossidante, può perdere nuovamente elettroni e tornare alla forma blu, carica e intrappolata. La chimica redox del colorante è quindi anche il suo meccanismo di trasporto. Cambiare il numero di elettroni significa cambiare la permeabilità.

Gli elettroni necessari alla prima fase provengono dalla cellula stessa. Le cellule dei mammiferi effettuano il trasporto di elettroni attraverso la membrana plasmatica, trasferendo equivalenti riducenti dai donatori intracellulari agli accettori sulla superficie. Questa attività transmembrana plasmatica è una normale funzione cellulare, presente nella maggior parte dei tipi cellulari, e la reduttasi sulla superficie endoteliale che agisce sui coloranti tiazinici si comporta come altre reduttasi sotto un aspetto significativo: continua a funzionare in presenza di cianuro e azide a dosi che bloccano le fasi successive. Questa separazione è il fulcro dell'intera spiegazione.

La ripartizione venne studiata per prima e quasi spiegò la captazione

Nel 1929, Marian Irwin del Rockefeller Institute si pose una domanda più semplice. Forse l'ingresso del colorante dipende soltanto dalla ripartizione tra l'acqua e gli strati lipidici della cellula, e uno strato di cloroformio può rappresentare questi strati lipidici in laboratorio. Nei suoi studi spettrofotometrici sulla penetrazione, agitò soluzioni acquose di colorante con cloroformio e confrontò ciò che passava nella fase organica con ciò che entrava nelle cellule vive delle alghe.

Due risultati di quel lavoro meritano ancora attenzione. Primo, le soluzioni commerciali di blu di metilene contenevano trimetiltionina, oggi chiamata Azure B, e questa impurità penetrava più rapidamente del blu di metilene stesso, soprattutto a pH alcalino, dove predomina la forma di base libera liposolubile. Parte dell'apparente ingresso del blu di metilene era in realtà un ingresso selettivo di Azure B. Secondo, il pH determinava l'esito regolando lo stato di ionizzazione, e le cellule danneggiate lasciavano entrare molto più colorante di quelle integre. I coefficienti di ripartizione e lo stato di carica governavano ciò che veniva assorbito sia dal sistema artificiale sia dalla cellula viva, e la somiglianza tra i due sosteneva l'idea della presenza di strati non acquosi al confine cellulare.

Il modello anticipava correttamente il ruolo dei lipidi e della ionizzazione, ma non poteva distinguere un colorante che si ripartisce nella propria forma da uno che viene trasformato chimicamente sulla superficie, attraversa la membrana sotto un'altra forma e viene riconvertito all'interno. Per fare questa distinzione serviva un esperimento diverso, che arrivò settant'anni dopo nell'endotelio polmonare.

Riduzione all'esterno, intrappolamento all'interno

Merker e colleghi lavorarono con cellule endoteliali dell'arteria polmonare bovina in coltura e proposero una sequenza in tre fasi: il colorante ossidato viene ridotto sulla superficie cellulare alla sua forma incolore e lipofila, la forma ridotta entra per diffusione e la riossidazione intracellulare rigenera la forma ossidata impermeante alla membrana, che si accumula. Il loro studio sulla captazione endoteliale dei coloranti tiazinici mise poi alla prova la sequenza cercando di interromperla in punti specifici.

Il primo strumento fu il ferricianuro, un accettore di elettroni che non può entrare nella cellula. Quando gli enzimi superficiali riducono il colorante blu alla sua forma incolore all'esterno della cellula, il ferricianuro può sottrargli quegli elettroni, rigenerando il colorante blu nel terreno prima che attraversi la membrana. Finché il ferricianuro era presente in eccesso (10 micromolare di colorante contro 50–500 micromolare di ferricianuro), la captazione del colorante si arrestava quasi del tutto; soltanto dopo il consumo del ferricianuro riprendeva alla velocità normale. La cinetica raccontava la stessa storia in un altro modo. Il ferricianuro scompariva a una velocità pressoché costante, coerente con un flusso stabile di riduzione sulla superficie che alimentava un mediatore riciclabile, mentre il colorante extracellulare scompariva in modo esponenziale man mano che la sua quantità disponibile si esauriva. Un flusso costante insieme a una riserva che si esaurisce significa che il segnale del ferricianuro indica una riduzione continua, non molecole di colorante che lasciano la soluzione.

Il secondo strumento eliminò del tutto la fase di attraversamento. Il gruppo legò il blu di toluidina O, un colorante tiazinico strettamente affine, a una grande catena di poliacrilammide, troppo grande per entrare nella cellula in entrambi gli stati di ossidazione. Le cellule continuavano a ridurre il colorante legato. La riduzione, quindi, non richiede alcun accesso all'interno della cellula. Il sistema responsabile è esposto sulla superficie oppure è elettricamente accoppiato a essa.

Seguì poi la separazione che dà il titolo all'articolo scientifico. Cianuro e azide a 2 millimolare sopprimevano fortemente l'accumulo del colorante e, al microscopio, le inclusioni blu scuro e viola che normalmente circondano il nucleo quasi scomparivano. Eppure nessuno dei due inibitori rallentava la riduzione extracellulare: il ciclo del ferricianuro continuava senza diminuzioni e il polimero non permeante veniva ancora ridotto. Il blocco si trovava a valle. Cianuro e azide arrestavano la riossidazione e il sequestro intracellulari, non la riduzione sulla superficie. I controlli di vitalità sostenevano questa interpretazione, poiché durante questi trattamenti le cellule trattenevano il loro enzima marcatore citosolico, la lattato deidrogenasi; la perdita di captazione non era quindi dovuta semplicemente a un effetto tossico o alla rottura della membrana.

Una cautela espressa nello studio resta valida. Le inclusioni blu si trovavano intorno al nucleo, ma non al suo interno, in accordo con un'ossidazione negli organelli subcellulari; tuttavia, lo studio non identificava quali organelli fossero coinvolti. Distribuzioni simili in altri tipi cellulari erano state definite lisosomiali sulla base di prove deboli. L'intrappolamento va considerato accertato, la sua localizzazione provvisoria. Chi vuole seguire il successivo percorso degli elettroni può approfondire il trasporto elettronico mitocondriale e la gestione redox e il quadro più ampio dell'assorbimento e della distribuzione in base alla via di somministrazione.

La colorazione non è l'esposizione

Un terzo studio mostra cosa succede quando questa logica di captazione viene confrontata con una misura biologica. Scott e colleghi scoprirono che la metil-beta-ciclodestrina, uno zucchero dalla forma toroidale, lega direttamente il blu di metilene, con una costante di associazione di circa 310 per molare per il complesso di inclusione, contro circa 5846 per molare per la dimerizzazione del colorante. Nei fibroblasti L929 questo legame bloccava sia la colorazione cellulare sia la stimolazione della captazione del glucosio: la preincubazione con la ciclodestrina impediva la colorazione blu, mentre la sua aggiunta successiva accelerava la decolorazione. Man mano che il segnale ottico blu scompariva dalle cellule, l'attivazione del trasporto del glucosio si attenuava in stretta concomitanza.

Gli autori interpretarono questa correlazione come un elemento a favore di un'interazione diretta tra il colorante e una proteina della via di attivazione del trasportatore del glucosio, piuttosto che di un meccanismo di stress ossidativo persistente. Questa deduzione è ragionevole, ma ha dei limiti. L'esperimento non identifica la proteina, non dimostra un legame con il trasportatore stesso e la correlazione tra decolorazione e perdita dell'effetto non può escludere tutte le vie mediate da processi redox.

La lezione che resta riguarda la misurazione. La colorazione ottica rileva il colorante visibile, ossidato e associato alle cellule. Non rileva affatto la frazione ridotta incolore: una cellula poco colorata può quindi contenere ancora equivalenti del colorante, mentre una cellula intensamente colorata indica la presenza di colorante ossidato intrappolato, non l'esposizione totale dei tessuti né l'entità dell'effetto. La stessa cautela vale su scala più ampia: confrontare la colorazione tra tipi cellulari o considerare una sezione di tessuto scura come prova di una maggiore esposizione ripete l'errore iniziale commesso osservando la coltura. La captazione è un ciclo di riduzione, diffusione e riossidazione, e qualsiasi singola istantanea della forma blu ne mostra soltanto una parte. Le conseguenze pratiche per la colorazione e la manipolazione in laboratorio e per l'interpretazione delle affermazioni su dose ed esposizione ne derivano direttamente.