Eksperimen yang mengaitkan metilen biru dengan respirasi seluler

Darah manusia yang telah didefibrinasi, dipanaskan hingga 37 °C selama tiga jam, mengonsumsi sekitar dua persen oksigen yang dikandungnya. Tambahkan sedikit metilen biru sebelum inkubasi, dan darah yang sama mengonsumsi sekitar enam puluh lima persen. Tidak ada yang berubah pada sel. Hanya larutannya yang berubah.

Angka itu berasal dari makalah tahun 1928 oleh George Harrop dan E. S. Guzman Barron di Johns Hopkins, dan menjadi asal pernyataan yang sering diulang bahwa metilen biru meningkatkan respirasi seluler. Pernyataan itu tidak salah, tetapi cakupannya lebih sempit daripada yang terdengar.

Apa yang sebenarnya diukur oleh angka dalam tabel

Titik akhirnya adalah penyerapan oksigen, yang ditentukan melalui analisis gas. Harrop dan Barron menyaring darah yang baru diambil melalui kapas pada 10 °C untuk menghilangkan sel darah putih, menjenuhkan sampel dengan oksigen, membaginya, menambahkan zat warna ke salah satu bagian, lalu menganalisis keduanya setelah inkubasi. Jumlah leukosit jarang melebihi sekitar seribu per milimeter kubik. Konsumsi oksigen dilaporkan sebagai bagian dari kandungan oksigen awal sampel yang telah hilang.

Mereka juga mengukur karbon dioksida, dan di sinilah metodenya menimbulkan masalah. Darah yang telah didefibrinasi melepaskan hingga dua milimol karbon dioksida per 100 mL pada jam pertama inkubasi karena alasan yang tidak berkaitan dengan reaksi yang sedang diteliti, sehingga hasil bagi respirasi dari darah utuh tidak dapat digunakan. Hanya sel yang telah dicuci dalam larutan Locke yang menghasilkan angka yang dapat ditafsirkan, dan nilainya berkisar antara 0.73 dan 0.80 baik dengan maupun tanpa zat warna.

Detail itu bukan hal sepele. "Respirasi" dalam makalah-makalah ini berarti pertukaran gas di dalam wadah tertutup. Kesenjangan antara konsumsi oksigen dan keluaran energi yang berguna dibahas secara terpisah dalam apa yang dapat dan tidak dapat diberitahukan oleh konsumsi oksigen tentang ATP.

Zat warna memberi tambahan terbesar ketika sel paling sedikit berespirasi

Eritrosit mamalia dewasa hampir tidak memiliki konsumsi oksigen yang dapat diukur. Eritrosit burung yang berinti memilikinya. Harrop dan Barron menguji keduanya, dan perbedaan ini menjadi dasar argumen mereka.

Pada sampel mamalia, zat warna menghasilkan peningkatan dua puluh hingga lima puluh kali lipat. Pada darah angsa, yang sel-selnya sudah berespirasi, lajunya tidak pernah meningkat lebih dari dua kali lipat. Semakin tinggi respirasi awal, semakin sedikit tambahan yang dapat diberikan zat warna.

Gradien yang sama muncul dalam satu spesies. Sampel manusia dari pasien dengan polisitemia vera, yang mengandung sel-sel imatur, mengonsumsi 11.3 persen oksigennya tanpa adanya zat warna, dibandingkan dengan 2.8 persen pada sel yang telah dicuci dari donor sehat. Zat warna hanya meningkatkannya menjadi 63.4 persen, percepatan enam kali lipat ketika sel normal mengalami percepatan hampir tiga puluh kali lipat. Zat warna mendorong sel dewasa ke arah perilaku sel imatur, dan itulah yang menurut para penulis sedang terjadi.

Sianida seharusnya menghentikannya

Sianida diketahui menghentikan oksidasi seluler. Harrop dan Barron tetap menambahkannya, bersama dengan zat warna.

Hasil darah sapi cukup mewakili. Kandungan oksigen turun dari 22.61 menjadi 22.03 persen volume selama tiga jam tanpa tambahan apa pun. Dengan metilen biru, nilainya turun menjadi 12.84. Dengan metilen biru dan kalium sianida satu per lima ribu molar, nilainya turun menjadi 12.74. Efek zat warna pada dasarnya tidak terpengaruh.

Gambar: rekaman mikrorespirasi berkelanjutan dari eritrosit manusia. Panah menandai penambahan metilen biru. Sebelumnya, jejak hampir datar; setelahnya, jejak meningkat secara stabil. Direproduksi dari Harrop dan Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Kesimpulan mereka adalah bahwa zat warna bertindak sebagai pembawa oksigen, "menyediakan suatu zat yang telah menghilang dari eritrosit mamalia dewasa yang tidak berinti." Dua tahun kemudian, Michaelis dan Salomon di Rockefeller Institute merumuskan perbedaan pendapat tersebut dalam bentuk yang bertahan hingga kini. Entah efek zat warna merupakan "sifat kebetulan dari zat warna tersebut," atau zat warna itu adalah "model bagi suatu zat yang belum diketahui di dalam organisme." Percabangan itu belum terselesaikan. Yang berubah adalah bahwa sel kini dapat dijelaskan dengan jauh lebih presisi.

Ekstrak hati melakukan hal yang sama

Michaelis dan Salomon menunjukkan bahwa ekstrak organ dengan air dingin menghasilkan stimulasi yang sama. Hati tikus memberikan efek terkuat, diikuti ginjal, limpa, dan testis. Otak, otot, dan serum darah hanya memberikan sedikit atau tidak ada efek.

Mereka kemudian menguji ekstrak tersebut terhadap karbon monoksida. Respirasi yang diinduksi oleh ekstrak maupun zat warna tidak berubah dalam campuran 98 persen karbon monoksida dan 2 persen oksigen. Campuran gas yang sama menghambat respirasi ragi dan eritrosit unggas berinti sekitar 60 hingga 80 persen, sejalan dengan uraian Warburg tentang ferment respirasi yang sensitif terhadap karbon monoksida. Dengan demikian, zat jaringan yang belum teridentifikasi itu bukanlah enzim Warburg.

Beberapa kandidat identitas tersingkir dalam prosesnya. Glutation tereduksi dan sistein hanya menghasilkan konsumsi oksigen yang diperlukan oleh oksidasi mereka sendiri. Koenzim Harden dan Young disingkirkan karena otot mengandung jumlah terbanyak tetapi menunjukkan hampir efek paling kecil. Sitokrom Keilin, yang diberi nama beberapa tahun sebelumnya, menghadapi kontradiksi yang sama. Usulan mereka sendiri, bahwa zat aktif berasal dari inti sel, mereka sebut hanya sebagai sebuah dugaan.

Efek tersebut memiliki syarat

Sel harus tetap utuh. Hemolisis oleh air suling atau pembekuan berulang menghilangkan respons terhadap zat warna maupun ekstrak, dan hemolisis parsial menguranginya secara proporsional.

Gula juga diperlukan. Glukosa, fruktosa, dan sukrosa mendukung respirasi yang diinduksi zat warna; manitol tidak. Tanpa gula sama sekali tidak terjadi respirasi, dan zat warna tampaknya merusak sel selama proses tersebut, sehingga glukosa yang ditambahkan satu atau dua jam kemudian tidak memulihkannya. Para penulis menduga zat warna mengoksidasi suatu komponen struktural yang dibutuhkan sel.

Pencahayaan meningkatkan efek zat warna secara signifikan, meskipun efeknya tetap jelas dalam gelap. Zat warna tereduksi lainnya berperilaku berbeda: toluylene blue menyamai atau melampaui metilen biru, sedangkan indigo disulfonate hampir tidak memberikan efek. Tidak ditemukan hubungan yang jelas antara potensial oksidasi-reduksi suatu zat warna dan besarnya efek, yang menurut para penulis disebabkan oleh permeabilitas membran dan toksisitas.

Efek tersebut mengikuti fermentasi, bukan respirasi

Penelitian Barron tahun 1930 beralih dari suspensi sel ke irisan jaringan organ tikus normal dan tumor hasil transplantasi.

Pada jaringan tanpa glikolisis aerobik, metilen biru tidak memberikan efek atau sedikit menekan konsumsi oksigen: ginjal sekitar 14 persen, pankreas sekitar 14 persen, hati sekitar 5 persen. Pada jaringan yang berfermentasi dalam kondisi beroksigen, zat warna meningkatkan konsumsi: limpa sekitar 8 persen, otak sekitar 13 persen. Peningkatan pada tumor berkisar dari sekitar 27 persen pada karsinoma payudara manusia hingga lebih dari 80 persen pada sarkoma ayam Rous, kira-kira sebanding dengan glikolisis aerobik masing-masing jaringan.

Gambar: setiap titik mewakili satu jenis jaringan. Sumbu horizontal adalah glikolisis aerobik; sumbu vertikal adalah perubahan konsumsi oksigen setelah metilen biru. Data dari Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tabel 6, PMID 19869777.

Eksperimen sianida kemudian menghasilkan gambaran terbalik. Ketika respirasi pada jaringan yang sebelumnya tidak merespons tersebut dihambat dengan sianida dan fermentasi menjadi tampak, zat warna kembali meningkatkan konsumsi oksigen: ginjal sekitar 59 persen, hati sekitar 19 persen, limpa sekitar 286 persen, testis sekitar 200 persen.

Barron mengusulkan bahwa zat warna dapat digunakan sebagai uji kemampuan fermentatif suatu sel atau jaringan, lalu menutup dengan sebuah spekulasi: beberapa generasi kultur tumor dalam medium yang mengandung zat warna mungkin suatu hari dapat membuat metabolisme tumor secara permanen menyerupai jaringan normal. Itu adalah pertanyaan penelitian yang ditulis pada 1930. Itu bukan klaim pengobatan.

Apa yang tidak mungkin diukur oleh eksperimen tersebut

Pada 1928 dan 1930, "respirasi" berarti konsumsi oksigen. Adenosin trifosfat pertama kali dilaporkan pada 1929, dan demonstrasi bahwa mitokondria terisolasi mengesterifikasi fosfat sambil memindahkan elektron baru muncul pada 1949. Tidak satu pun makalah awal tentang metilen biru dapat mengukur produksi energi, dan tidak satu pun mengklaim telah melakukannya.

Sel menjadi masalah kedua. Eritrosit mamalia dewasa tidak mengandung mitokondria. Selama tahap retikulosit, sel menyingkirkan mitokondria dan ribosom melalui autofagi selektif, sehingga sel darah merah dewasa bergantung pada glikolisis dan terutama menggunakan jalur pentosa fosfatnya untuk NADPH, bukan untuk ATP. Dalam eksperimen tahun 1928 tidak ada rantai transpor elektron yang dapat diperbaiki. Apa pun yang mengonsumsi oksigen sedang melakukan sesuatu yang lain.

Apa yang sebenarnya terjadi kini telah dijelaskan dengan cukup baik. Metilen biru menerima elektron dari ekuivalen pereduksi seluler dan berubah menjadi leucomethylene blue, yang kemudian dioksidasi kembali oleh oksigen molekuler sehingga siklus tertutup. Pada sel darah merah manusia, flavin reduktase yang bergantung pada NADPH dan reduktase disulfida terkait menjalankan tahap reduksi. Sebuah penelitian tahun 1976 menggunakan glukosa berlabel menemukan bahwa zat warna menstimulasi jalur pintas monofosfat heksosa, bahwa efek pada konsentrasi rendah bergantung pada oksihemoglobin, dan bahwa konsentrasi yang lebih tinggi, 0.1 mM, menghasilkan hidrogen peroksida. Zat warna tereduksi yang bertemu oksigen menghasilkan peroksida, bukan ikatan fosfat.

Di mitokondria, gambaran sebenarnya lebih diperdebatkan daripada yang diakui dalam ringkasan populer. Satu jalur penelitian menyatakan bahwa zat warna mengambil elektron dari wilayah kompleks I dan menyerahkannya kepada sitokrom c. Penelitian lain menemukan bahwa pada mitokondria otak tikus, zat warna tidak dapat memulihkan respirasi setelah blok antimycin, dan menempatkan akseptor elektron pada lokasi pengikatan ubiquinol di kompleks III. Penelitian ketiga menemukan bahwa konsentrasi rendah meningkatkan konsumsi oksigen saat istirahat tanpa mengubah respirasi yang distimulasi ADP. Pernyataan paling langsung mengenai hal ini adalah bahwa konsumsi oksigen yang diinduksi metilen biru sama sekali tidak bergantung pada fosforilasi oksidatif: konsumsi itu tetap berlangsung ketika rantai respirasi dihambat, dan dalam preparat yang bahkan tidak memilikinya.

Pengukuran langsung atas kesenjangan antara kedua besaran tersebut juga tersedia. Pada mitokondria hati tikus terisolasi, peningkatan konsentrasi zat warna menurunkan rasio kontrol respirasi dan menyebabkan pembengkakan, yang oleh para penulis digambarkan sebagai pelepasan kopling fosforilasi oksidatif. Pada hati tikus yang diperfusi, metilen biru meningkatkan konsumsi oksigen sementara rasio ATP terhadap ADP turun.

Catatan klinis menyampaikan pesan yang sama. Methemoglobinemia ditangani dengan sekitar satu hingga dua miligram metilen biru per kilogram secara intravena, melalui jalur reduksi yang bergantung pada NADPH, dan dosis yang lebih besar menyebabkan kondisi yang sedang ditangani tersebut. Tinjauan yang sama mencatat bahwa efek antidot paling besar pada eritrosit utuh dan berkurang ketika terjadi hemolisis, yang merupakan temuan hemolisis tahun 1930 yang muncul kembali tujuh puluh tiga tahun kemudian dalam konteks rumah sakit. Senyawa yang efek bermanfaat dan merugikannya berada pada sisi yang berlawanan dari suatu ambang dosis bukanlah senyawa yang dosisnya seharusnya disimpulkan dari pengukuran konsumsi oksigen.

Mengapa batch termasuk bagian dari pembahasan

Harrop dan Barron mencatat sesuatu yang layak dibaca kembali. Metilen biru sendiri menghasilkan pita dalam spektroskop di antara dua pita khas methemoglobin, "yang dapat dengan mudah menyebabkan kekeliruan pada pengamatan sepintas." Zat warna dapat meniru zat yang sedang dicari.

Masalah yang sama memiliki bentuk kimia. Fenotiazin terkait yang hadir sebagai konstituen minor memiliki perilaku redoks, permeabilitas, dan toksisitasnya sendiri. Satu kasus terdokumentasi memperjelas konsekuensinya: dalam penelitian iodisasi metilen biru, sampel yang mengandung sekitar 7 hingga 8 persen Azure B terutama menghasilkan Azure B teriodinasi, sehingga pengotor tersebut, bukan metilen biru, mendominasi reaksi.

Siapa pun yang menggunakan metilen biru sebagai reagen, di laboratorium, di meja pewarnaan, atau di akuarium, bekerja dengan bahan yang komposisinya tidak sepenuhnya diketahui kecuali batch tersebut telah dikarakterisasi. Zat terkait, identitas, pengotor unsur, pelarut residu, dan residu pada pemijaran merupakan bagian dari eksperimen, bukan sekadar dokumen administratif di sekitarnya. Blupreme memperoleh metilen birunya dari produsen farmasi dan menerbitkan sertifikat analisis lengkap, dengan pengujian seluruh spesifikasi USP alih-alih hanya logam berat; panduan membaca sertifikat analisis dan apa yang dapat dan tidak dapat ditetapkan oleh penetapan grade USP menjelaskan cara memeriksa dokumen terhadap klaimnya.

Angkanya benar

Eksperimen tahun 1928 dan 1930 dilakukan dengan cermat, dan pengamatan utamanya tetap bertahan: zat warna yang dapat direduksi dapat membuat sel yang hampir tidak berespirasi mengonsumsi oksigen berkali-kali lipat dibandingkan laju istirahatnya, tanpa melewati tahap yang dihambat oleh sianida.

Kesalahan muncul kemudian, ketika "respirasi" dibaca dengan makna modernnya. Pengukuran pertukaran gas memberi tahu Anda bahwa elektron telah sampai ke oksigen. Pengukuran itu tidak memberi tahu Anda bahwa sebagian elektron tersebut digunakan untuk membuat ATP, dan pada sel tanpa mitokondria, jarak antara kedua pernyataan itu sebesar mungkin. Peta yang lebih luas tentang apa yang dilakukan metilen biru di dalam sel menempatkan perbedaan yang sama dalam kerangka yang lebih luas, dan sejarah senyawa ini dari zat warna hingga obat menjelaskan bagaimana suatu pewarna tekstil sampai pada eksperimen-eksperimen ini. :::