Povijest metilenskog plavila: od bojila do lijeka i istraživanja

Metilensko plavilo stiglo je do pacijenta prije nego što je stiglo u ljekarnu.

Izvještaj Paula Guttmanna i Paula Ehrlicha iz 1891. o uporabi tog bojila kod malarije sadrži dva grafikona temperature. Drugi obuhvaća razdoblje od 13. srpnja do 5. kolovoza, a terapija je iz dana u dan upisana uz rub. Zapisi za 18. i 19. srpnja glase "1 × 0,05 Methylenblau". Sljedećih dana navedeno je pet i sedam doza iste količine, a do 22. srpnja u zapis je uključena i mala količina kinina. Linija temperature, koja se u prvoj polovici grafikona kreće između 37 °C i 39.5 °C, izravnava se nakon pojave bojila i tijekom preostala tri tjedna ostaje između približno 36 °C i 37.5 °C.

Pacijent je bio jedan od dvojice muškaraca, opisanih u radu kao kućni sluga i mornar. Spoj koji su primili već je petnaest godina bio komercijalno tekstilno bojilo, a ta dvojica muškaraca među prvim su zabilježenim ljudima liječenima potpuno sintetskim lijekom usmjerenim na određeni organizam.

Bojilo je bilo prvo

Prvo komercijalno uspješno sintetsko bojilo stvorio je William Henry Perkin 1856. Perkin je imao osamnaest godina, radio je u kućnom laboratoriju tijekom uskrsnih praznika i pokušavao sintetizirati kinin. Umjesto toga dobio je crni ostatak, otopio ga i otkrio boju koja se izvanredno vezala za svilu. Patentirao ju je u kolovozu 1856., a do kraja 1857. imao je tvornicu koja je opskrbljivala londonsku bojadisaonicu svile.

Adolf von Baeyer sintetizirao je 1875. crveno bojilo i nazvao ga eozin, prema Eos, grčkoj riječi za zoru. Heinrich Caro, tada direktor laboratorija u Badische Anilin- und Soda-Fabrik, razvio je 1876. s Baeyerom metilensko plavilo kao bojilo na bazi anilina za pamuk. Njegova kemijska struktura utvrđena je tek otprilike devet godina poslije.

To se podrijetlo i danas vidi u nazivu tvari. "Methylene blue" trgovački je naziv iz kataloga bojila, a ne kemijski opis. Spoj na koji se odnosi jest metiltioninijev klorid, a razlike između naziva, soli i njezinih hidrata postaju važne čim netko važe materijal ili čita specifikaciju.

Bojenje je bilo most

Put od proizvodnje bojila do bolnice vodio je kroz mikroskop, a započeo je prije nego što je metilensko plavilo postojalo. Wilhelm Erb bio je prvi koji je primijenio sintetsko bojilo na krv, koristeći pikrinsku kiselinu 1865., i u nekim je crvenim krvnim stanicama uočio retikularni uzorak.

Doktorska disertacija Paula Ehrlicha iz 1878. usporedila je histološko bojenje s bojenjem tekstila i tvrdila da su oba procesa kemijske reakcije. Radeći pod Robertom Kochom na bacilu tuberkuloze, razvrstao je anilinska bojila u kisele i bazične skupine te utvrdio da svaka skupina boji različite dijelove stanice. Godine 1880. pomiješao ih je: zasićenu otopinu metilenskog plavila ulijevao je u kiseli fuksin dok se supernatant nije izbistrio. Rezultat, koji je nazvao neutralen Farbkörper ili neutralna boja, davao je tri boje umjesto jedne, otkrio granule u polimorfonuklearnim stanicama koje prije nisu bile vidljive i omogućio prvi diferencijalni broj leukocita. Budući da su te granule vezale obje komponente smjese, Ehrlich je za stanice koje ih nose skovao naziv neutrofil.

Dvije godine poslije Koch je upotrijebio metilensko plavilo za pronalaženje bacila tuberkuloze, a Ehrlich je 1883. poboljšao metodu. Godine 1886. objavio je drukčiju vrstu opažanja: ubrizgao je bojilo živim životinjama i usporedio koliko ga snažno pojedini organi preuzimaju te zaključio da pokazuje izražen afinitet prema mozgu i živčanom tkivu. Taj je afinitet pripisao oksidacijsko-redukcijskom ciklusu bojila, koji je uočio prethodne godine. Zbog tog ciklusa otopina metilenskog plavila gubi boju kada se potroši kisik i ponovno je dobiva kada se vrati zrak. Pokusi koji su prvi izmjerili posljedice tog ciklusa pripadaju kasnijem desetljeću, a sam mehanizam zasebna je tema od povijesti.

Parazit i ljubičasta jezgra

Alphonse Laveran pronašao je parazita malarije 1880. pregledavajući svježu, neobojenu krv. Za njegovo rutinsko uočavanje u osušenom razmazu bilo je potrebno bojilo, a tadašnja su bojila davala samo crvenu i plavu boju.

Poljski patolog Czesław Cheçinski zamijenio je 1888. kiseli fuksin eozinom i dobio smjesu metilenskog plavila i eozina. Slučaj na kojem se temeljila njegova metoda bio je vojnik koji je umro od malarije 30. rujna 1887. U krvnim razmazima Cheçinski je vidio plave oblike nalik tratinčicama, danas prepoznate kao Plasmodium malariae, i srpaste oblike, danas prepoznate kao gametocite vrste Plasmodium falciparum. Rezultat je istodobno okončao dva suparnička objašnjenja bolesti: teoriju mijazme i tvrdnju Edwina Klebsa i Corrada Tommasi-Crudelija da malariju uzrokuje bakterija.

Parazit je bio vidljiv. Njegova jezgra nije, zbog čega je njegova priroda ostala nerazjašnjena. Ernst Malachowski, liječnik u Breslauu, riješio je taj problem najprije slučajno, a zatim namjerno. Godine 1889. primijetio je diferencijalno bojenje jezgre plazmodija u jednom preparatu, ali ga nije mogao ponoviti. Zakiseljavanje metilenskog plavila nije pomoglo. Alkaliziranje boraksom svaki je put proizvelo isti učinak. Tehniku je javno demonstrirao 15. lipnja 1890. i objavio iste godine, a detaljniju metodu u kolovozu 1891.

Dmitri Romanowsky objavio je vlastitu inačicu u rujnu 1891. Najbolje rezultate dobio je iz zanemarene, pljesnive boce otopine metilenskog plavila stare više od dva mjeseca. Malachowskijev postupak bio je namjeran i, prema njegovim riječima, lako ponovljiv; Romanowskijev je bio slijepa ulica koja je uspjela jednom. Eponim je ipak pripao Romanowskom, a spor o tome tko je proizveo ljubičastu boju koja je jezgru učinila vidljivom zasebna je priča s vlastitim dokumentima.

Slika: drugi grafikon temperature iz izvještaja Guttmanna i Ehrlicha iz 1891. Gornji dio obuhvaća razdoblje od 13. do 24. srpnja, a donji od 25. srpnja do 5. kolovoza; zapisi uz rub navode primijenjene doze, a temperatura tijekom posljednja tri tjedna zapisa ostaje blizu normale. Reproducirano iz izvještaja skeniranog za Kraftsa, Hempelmanna i Skórsku-Staniu, Parasitology Research* 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Pokazalo se da je sazrijevanje demetilacija

Nitko uključen tijekom 1890-ih nije znao što "sazrijevanje" čini metilenskom plavilu. Odgovor je došao iz industrijske kemije. Heinrich August Bernthsen sintetizirao je matični spoj fenotiazin 1883., utvrdio 1885. da metilensko plavilo pripada toj skupini i u istom razdoblju pokazao da alkalni uvjeti uklanjaju metilne skupine s bojila, stvarajući spojeve koji se danas nazivaju azurima.

Bernard Nocht izdvojio je aktivnu frakciju 1898. i 1899. i mogao ju je nazvati samo Rot aus Methylenblau, crveno iz metilenskog plavila. Michaelis ju je 1901. identificirao kao azur I. Jenner je 1899. uveo apsolutni metanol kao otapalo za talog bojila, čime je uklonjena potreba za toplinskom fiksacijom krvnih razmaza; Leishman i Reuter spojili su oba napretka; Wright je 1902. objavio pojednostavljenu metodu. Giemsin doprinos, također iz 1902., bio je prestanak oslanjanja na nasumično sazrelu otopinu i uporaba odmjerenih količina poznatih bojila. Zatim je odbio objaviti kako proizvodi čisti metilenski azur i prodao metodu laboratoriju Dr. Grüblera, koji je proizvod plasirao kao azur I i tvrdio da je samo njegova verzija autentično Giemsino bojilo.

Dva svjetska rata slučajno su dovršila taj posao. Kada su njemačka bojila postala nedostupna, Lillie, Roe i Wilcox radili su na američkim zamjenama i utvrdili da najbolje bojenje daju tri odvojene komponente: čisto metilensko plavilo, njegov produkt razgradnje azure B i eozin. Te tri komponente i danas ostaju glavne sastavnice bojila koje se koristi za dijagnosticiranje malarije, pod nazivom koji sada zajedno povezuje Malachowskog, Wrighta i Giemsu.

Slika: prstenasti oblici vrste Plasmodium falciparum* u ljudskim crvenim krvnim stanicama, obojeni metodom tipa Romanowsky. Ljubičasta struktura unutar prstena jest kromatin koji je Malachowskijevo metilensko plavilo tretirano boraksom prvi put učinilo vidljivim. Slika Ernsta Hempelmanna, objavljena u javnoj domeni.

Jedan naziv, više materijala

Godine tijekom kojih su te komponente razdvajane ostavile su problem koji je nadživio samu kemiju. Ralph Lillie povukao je 1969. granicu između bioloških bojila, "proizvedenih prema strogim specifikacijama primjerenima njihovoj osjetljivoj i zahtjevnoj uporabi", i nebioloških bojila za bojenje tekstila, koja "zahtijevaju manje stroge i zahtjevne proizvodne standarde". Obje vrste proizvoda nosile su isti naziv, a razlika među njima nikada nije bila samo pitanje stupnja. Specifikacija napisana za pamuk i specifikacija napisana za dijagnostički reagens nisu međusobno zamjenjive, a materijal proizveden prema tekstilnoj specifikaciji nije bio namijenjen gutanju.

Azure B najjasniji je primjer. To je monodemetilirani oblik metilenskog plavila, ima vlastitu mjerljivu farmakološku aktivnost i više je od jednog stoljeća bio prisutan kao nekontrolirani sastojak kliničkih pripravaka metilenskog plavila prije nego što je itko razdvojio ta dva spoja. Jedna je skupina utvrdila da je ljudsko tkivo uzorkovano pri obdukciji nakon primjene metilenskog plavila sadržavalo 5 do 14 posto nepromijenjenog metilenskog plavila i 86 do 95 posto azure B. Treba li određeni pripravak sadržavati azure B i u kojoj granici pitanje je specifikacije, a istraživanje azure B kao nečistoće i metabolita nastavlja od te točke.

U specifikaciji se nalazi i praktična posljedica. Usklađenost s USP-om put je do najviše čistoće koju tržište nudi, jer je riječ o cjelovitom objavljenom standardu ispitivanja, a ne o jednom mjerenju. Obuhvaća identitet, sadržaj, organske nečistoće uključujući azurna bojila, ostatna otapala, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granice i bakterijske endotoksine. Certifikat koji navodi rezultat za teške metale i naziva ga usklađenošću s USP-om naveo je samo jednu stavku s tog popisa.

Blupreme nabavlja metilensko plavilo od farmaceutskog proizvođača i objavljuje potpuni certifikat analize, ispitujući cijelu USP specifikaciju, a ne samo teške metale. Vodič za čitanje certifikata analize i što oznaka USP utvrđuje, a što ne objašnjavaju kako dokument usporediti s navedenom tvrdnjom.

Što povijest opravdava, a što ne

Ta je povijesna linija stvarna i dulja nego što većina stranica proizvoda daje naslutiti. Metilensko plavilo korišteno je za liječenje malarije 1891., 1899. opisano je kao sedativ kod agitiranih psihoza, a njegov bočni lanac povezuje se s kinakrinom, klorokinom, prometazinom i klorpromazinom. Ehrlichov rad iz 1890. s Arthurom Leppmannom opisao je ublažavanje neuralgične i reumatske boli, a zatim razmotrio i odbio ispitati bojilo kod mentalnih bolesti.

Ništa od toga ne utvrđuje suvremenu primjenu. Rezultat iz 1891. za malariju temeljio se na dva pacijenta i grafikonu temperature. Dugotrajna poznatost molekule razlog je za njezino proučavanje, a ne rezultat. Povijest spoja kao lijeka i suvremena ispitivanja kod malarije odgovaraju na drukčija pitanja od onih koja je postavljao Ehrlich, a ishode treba tumačiti prema njihovim vlastitim kriterijima.

U zapisu postoji jedan detalj koji pripada sadašnjosti, a ne prošlosti. Kada su istraživači tijekom 2000-ih provodili ispitivanja metilenskog plavila protiv malarije u Burkini Faso, morali su se natjecati za materijal farmaceutske kvalitete te su izvijestili da je cijena sirovine porasla za približno stotinu puta nakon dobivanja GMP validacije. Bojilo se moglo zamijeniti. Lijek nije mogao. Razlika koju je Lillie povukao 1969. ista je ona koja i danas određuje što se nalazi u bočici.