प्रयोगशाला में मेथिलीन ब्लू की पहचान: अवरक्त स्पेक्ट्रा और पूरक विधियाँ

कल्पना करें कि तीन प्रयोगशालाओं को एक ही नीला पाउडर मिलता है। पहली उसका अवरक्त स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करके उसे मेथिलीन ब्लू घोषित करती है। दूसरी क्रोमैटोग्राफी करके 0.4% Azure B की रिपोर्ट देती है। तीसरी क्रिस्टलों से एक्स-रे का विवर्तन कराकर एक हाइड्रेट रूप की पहचान करती है। तीनों सही हैं, और किसी ने भी बाकी दो प्रश्नों का उत्तर नहीं दिया है। भ्रम तब शुरू होता है जब एक परिणाम को तीनों प्रश्नों का उत्तर मान लिया जाता है।

यह लेख इन प्रश्नों को अलग करता है। अवरक्त पहचान किसी संदर्भ मानक से तुलना करके आणविक पहचान स्थापित करती है। क्रोमैटोग्राफी संघटन स्थापित करती है। विवर्तन ठोस अवस्था का रूप स्थापित करता है। पहचान के परीक्षण में सफल मिलान शुद्धता का प्रमाणपत्र नहीं है।

अवरक्त पहचान एक प्रश्न का स्पष्ट उत्तर देती है

मेथिलीन ब्लू के लिए औषधकोशीय पहचान परीक्षण में स्पेक्ट्रम की तुलना मानक से की जाती है, न कि शिखरों की किसी जाँच-सूची से। USP मेथिलीन ब्लू मोनोग्राफ के पूर्वावलोकन के अनुसार, पहचान परीक्षण A में ATR प्रकाशिकी या पोटैशियम ब्रोमाइड की गोली के साथ अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी का उल्लेख है। नमूने का स्पेक्ट्रम USP संदर्भ मानक के स्पेक्ट्रम के अनुरूप होना चाहिए, और नमूने तथा मानक को समतुल्य परिस्थितियों में तैयार करके रिकॉर्ड किया जाना चाहिए। निदानात्मक तरंगसंख्याओं की कोई निश्चित सूची परिणाम तय नहीं करती। दोनों स्पेक्ट्रा को एक-दूसरे पर रखकर किया गया मिलान इसे तय करता है।

परीक्षण की यह व्यवस्था मेथिलीन ब्लू के FTIR स्पेक्ट्रा के व्यवहार को ध्यान में रखती है। सबसे प्रबल विशेषताएँ फिंगरप्रिंट क्षेत्र में होती हैं। प्रकाशित साहित्य में बैंडों के निर्धारण लगातार मुख्य संयुग्मित वलय बैंड को 1590 से 1600 cm-1 के पास रखते हैं, जहाँ एरोमैटिक कार्बन-कार्बन और कार्बन-नाइट्रोजन के खिंचाव कंपन युग्मित होते हैं। 1490 और 1390 cm-1 के पास के अन्य बैंडों में वलय, कार्बन-नाइट्रोजन और कार्बन-हाइड्रोजन विरूपण का योगदान होता है। 1355 और 1330 cm-1 के पास के बैंडों में डाइमेथिलअमीनो कार्बन-नाइट्रोजन बंध और मेथिल विरूपण शामिल होते हैं। 1225 से 1250 cm-1 के पास की विशेषताएँ विषमचक्रीय ढाँचे से संबंधित होती हैं, जबकि 1170 से 1130 और 1066 cm-1 के पास के बैंडों में कार्बन-सल्फर का योगदान होता है और 880 cm-1 के पास एरोमैटिक C-H का बंकन होता है। खिंचाव कंपन अधिक तरंगसंख्याओं पर दिखाई देते हैं: एरोमैटिक C-H लगभग 3040 cm-1 पर और N-मेथिल C-H लगभग 2900 और 3000 cm-1 के बीच। प्रकाशित निर्धारणों के विवरण अलग-अलग होते हैं, क्योंकि फीनोथायज़िनियम ढाँचा एक युग्मित प्रणाली के रूप में कंपन करता है। इसलिए किसी एक निर्धारण तालिका को प्रकाशित व्याख्या मानें, एकमात्र संभव व्याख्या नहीं।

नमूना तैयार करने के दो प्रभावों पर ध्यान देना आवश्यक है, क्योंकि वे रंजक को बदले बिना मेथिलीन ब्लू के IR स्पेक्ट्रा बदल देते हैं। पहला, जलयोजित पदार्थ में लगभग 3300 से 3500 cm-1 पर एक चौड़ा O-H बैंड-समूह और 1630 से 1640 cm-1 के पास जल का बंकन दिखाई देता है। अलग-अलग हाइड्रेट रूप फिंगरप्रिंट बैंडों में मापने योग्य स्थानांतरण भी उत्पन्न करते हैं। दूसरा, KBr गोली का मैट्रिक्स आर्द्रताग्राही होता है: अवशोषित नमी ठीक उन्हीं जल-संबंधी क्षेत्रों में बैंड उत्पन्न करती है और उसे नमूने के हाइड्रेट जल के रूप में गलत समझा जा सकता है। ATR से नमूना परीक्षण करने पर KBr मैट्रिक्स की आवश्यकता नहीं होती, लेकिन ATR की तीव्रताएँ तरंगसंख्या पर निर्भर प्रवेश गहराई के अनुसार बदलती हैं। इसलिए एक ही पाउडर के ATR स्पेक्ट्रम और संचरण स्पेक्ट्रम को सीधे एक-दूसरे पर रखकर नहीं मिलाया जा सकता। औषधकोशीय आवश्यकता से व्यावहारिक नियम स्पष्ट होता है: एक ही तकनीक से रिकॉर्ड किए गए नमूने और संदर्भ की तुलना करें, और इस्तेमाल की गई तकनीक का रिकॉर्ड रखें। इन स्पेक्ट्रा के पीछे धनायन, लवण और हाइड्रेटों के रसायन को समझने के लिए मेथिलीन ब्लू की संरचना और गुणों का संदर्भ देखें।

विश्लेषण विधि चुनने की तालिका

यह तालिका विधि चुनने का साधन है। प्रत्येक पंक्ति में देखें कि विधि किस प्रश्न का उत्तर देती है, स्वीकार्य परिणाम क्या स्थापित करता है और क्या अप्रमाणित रहता है।

अवरक्त स्पेक्ट्रम का मिलान शुद्धता का प्रमाणपत्र क्यों नहीं है

पहचान का मिलान गलत रंजक की संभावना को खारिज करता है। यह नमूने के सभी घटकों की सूची नहीं देता। तीन सीमाएँ सबसे अधिक महत्त्वपूर्ण हैं।

पहली, निकट संबंधी रंजक अवरक्त क्षेत्र में एक जैसे दिखते हैं। Azure B और मेथिलीन ब्लू में केवल एक मेथिल समूह का अंतर है, इसलिए उसका स्पेक्ट्रम मेथिलीन ब्लू के स्पेक्ट्रम से बहुत मिलता-जुलता है। कुछ प्रतिशत Azure B वाला मिश्रण भी मेथिलीन ब्लू के संदर्भ स्पेक्ट्रम से अच्छी तरह मिल जाता है। उस अशुद्धि का पता लगाना क्रोमैटोग्राफी का काम है, जिसकी चर्चा मेथिलीन ब्लू की अशुद्धियों और परीक्षण विधियों की मार्गदर्शिका में की गई है।

दूसरी, अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी पूरे नमूने का सामूहिक विश्लेषण करने वाली तकनीक है, जिसकी अल्प मात्रा वाले घटकों के प्रति संवेदनशीलता सीमित होती है। संबंधित रंजकों, अवशिष्ट विलायकों या अकार्बनिक अवशेषों की छोटी मात्राएँ प्रमुख बैंडों के नीचे छिप जाती हैं। अतिरिक्त शिखरों का न दिखना अशुद्धियों की अनुपस्थिति का कमजोर प्रमाण है।

तीसरी, पूरी तुलना संदर्भ मानक पर निर्भर करती है। अपघटित मानक, जलयोजन के कारण स्थानांतरित स्पेक्ट्रम वाला मानक या गलत ढंग से संभाला गया मानक तुलना का आधार बदल देता है। असंगत तकनीकों की तुलना भी ऐसा ही करती है, जैसे ATR नमूना स्पेक्ट्रम को KBr संदर्भ से परखना। प्रत्येक निष्कर्ष के साथ मानक का लॉट, तकनीक और तैयारी का रिकॉर्ड रखें।

मिश्रणों के मामले में एक और सावधानी आवश्यक है। ऐसा स्पेक्ट्रम जो अधिकतर मेल खाता हो, लेकिन उसमें शोल्डर या तीव्रता की विसंगतियाँ हों, टिप्पणियाँ जोड़कर स्वीकार करने योग्य परिणाम नहीं है। यह पहचान से पहले नमूने के घटकों को अलग करने का संकेत है।

व्यवहार में पूरक विधियाँ

मेथिलीन ब्लू का HPLC परीक्षण संघटन का वह उत्तर देता है जो अवरक्त परीक्षण नहीं दे सकता। वर्तमान औषधकोशीय विधि में फेनिल प्रकार का कॉलम और ट्राइफ्लुओरोएसीटिक अम्ल युक्त जल-एसीटोनाइट्राइल ग्रेडिएंट इस्तेमाल होता है। संसूचन 246 nm पर किया जाता है, दृश्य बैंड में नहीं। पहचान संदर्भ मानक के अवधारण समय से मेल के आधार पर होती है; उसी तुलना से मात्रा निर्धारण भी किया जाता है। कार्बनिक अशुद्धि परीक्षण में Azure B की पहचान उसके अपने संदर्भ पदार्थ से की जाती है। मेथिलीन ब्लू के 1.0 सापेक्ष अवधारण के मुकाबले इसका सापेक्ष अवधारण लगभग 0.8 होता है, और परीक्षण में दोनों शिखरों के बीच उच्च विभेदन आवश्यक होता है। तरंगदैर्घ्य के चयन पर ध्यान दें: डीमेथिलीकरण शृंखला में अवशोषण क्रमशः लाल क्षेत्र की ओर बढ़ता है, लगभग 600 nm पर थायोनिन से शुरू होकर Azure C, Azure A और Azure B के रास्ते लगभग 670 nm पर मेथिलीन ब्लू तक। इसलिए लगभग 660 nm पर स्थिर संसूचक पूरी शृंखला के लिए असमान प्रतिक्रिया देता है और कुछ समजात रंजकों की मात्रा कम दर्शाता है। आवश्यकता होने पर पूरी शृंखला की पूर्ण प्रोफाइलिंग प्रत्येक विश्लेष्य के लिए योग्य ठहराए गए मानकों के साथ C18 LC-MS/MS विधि से की जानी चाहिए।

पाउडर विवर्तन ठोस अवस्था के उस प्रश्न का उत्तर देता है जिसे ऊपर की दोनों विधियाँ या तो नष्ट कर देती हैं या अनदेखा करती हैं: क्रोमैटोग्राफी के लिए पाउडर को घोलने से क्रिस्टल की जानकारी मिट जाती है, और आणविक कंपन बंधों की जानकारी देते हैं, दूर तक फैली क्रिस्टलीय व्यवस्था की नहीं। विवर्तन पैटर्न हाइड्रेट प्रावस्थाओं और क्रिस्टलीयता में अंतर करते हैं, और अधिकांश पदार्थों की तुलना में मेथिलीन ब्लू को इस जाँच की अधिक आवश्यकता होती है। Rager और सहकर्मियों के ठोस अवस्था संबंधी अध्ययन ने पाँच अलग हाइड्रेट संरचनाओं की पहचान की: एक पेंटाहाइड्रेट, दो डाइहाइड्रेट, एक मोनोहाइड्रेट और एक मध्यवर्ती हाइड्रेट। जिन रूपों का अभिलक्षण किया गया, उनमें कोई वास्तविक ट्राइहाइड्रेट नहीं मिला। यहाँ प्रयोगशाला में नमूने को संभालने का तरीका महत्त्वपूर्ण है: आर्द्रता और तापमान हाइड्रेट की स्थिरता बदलते हैं, और बहुत अधिक पीसने से प्रावस्था बदल सकती है या क्रिस्टलीयता घट सकती है। इसलिए सापेक्ष आर्द्रता और तापमान को नियंत्रित करें और उनका रिकॉर्ड रखें, तथा पिसाई न्यूनतम रखें। हाइड्रेट की लेबलिंग और तौले गए द्रव्यमान पर उसके प्रभाव की आगे चर्चा मेथिलीन ब्लू के हाइड्रेट रूप और लेबलिंग में की गई है।

UV-Vis अवशोषण सहायक भूमिका निभाता है। परिचित अवशोषण अधिकतम विलयन के अपेक्षित व्यवहार की पुष्टि करते हैं और सांद्रता निर्धारण में सहायक होते हैं। लेकिन अपेक्षित तरंगदैर्घ्य पर अवशोषण करने वाला नीला विलयन मेथिलीन ब्लू के अनुरूप तो है, उसकी पहचान का प्रमाण नहीं, क्योंकि संबंधित रंजक भी आसपास के तरंगदैर्घ्यों पर अवशोषण करते हैं।

खरीदने से पहले क्या पूछें

इन अंतरों को खरीद संबंधी प्रश्नों में बदलें। पूछें कि किस लॉट का परीक्षण किया गया, किस तकनीक से पहचान स्थापित की गई, क्या HPLC अशुद्धि परीक्षण में Azure B का संदर्भ पदार्थ इस्तेमाल हुआ, और क्या हाइड्रेट रूप का अभिलक्षण किया गया या उसे मान लिया गया। सबसे बढ़कर, पूछें कि प्रमाणपत्र पूरे विनिर्देश को कवर करता है या केवल चुने हुए परीक्षणों को। औषधकोशीय अनुरूपता का दावा करने वाले कई विक्रेता केवल भारी धातुओं का परीक्षण करते हैं। इससे पहचान, मात्रा निर्धारण, कार्बनिक अशुद्धियों, विलायकों और सूक्ष्मजीवों से संबंधित प्रश्न अनुत्तरित रह जाते हैं।

Blupreme मेथिलीन ब्लू के एक औषध निर्माता के साथ साझेदारी में पूरे USP विनिर्देश का परीक्षण करता है। इसमें पहचान, शुद्धता, कार्बनिक अशुद्धियाँ, अवशिष्ट विलायक, तत्त्वीय अशुद्धियाँ, प्रज्वलन के बाद अवशेष, सूक्ष्मजीवी सीमाएँ और जीवाणु एंडोटॉक्सिन शामिल हैं। प्रत्येक बैच का सार्वजनिक विश्लेषण प्रमाणपत्र Blupreme गुणवत्ता परीक्षण पर प्रकाशित किया जाता है, ताकि मात्रा निर्धारण का आधार और अशुद्धियों के परिणाम अनुमान लगाने के बजाय सीधे पढ़े जा सकें। 100% के करीब के परिणामों के लिए भी उनकी गणना का आधार बताना आवश्यक है, जैसा कि 100 प्रतिशत से अधिक मात्रा निर्धारण परिणामों की मार्गदर्शिका समझाती है। पहचान का मिलान जाँच की शुरुआत करता है। पूरा रिकॉर्ड उसे पूर्ण करता है।