צביעה במתילן כחול: שיטות מיקרוסקופיה ואטלס של תמונות אמיתיות

צביעה במתילן כחול מקלה על ההבחנה במאפיינים תאיים שאחרת נראים בקושי במיקרוסקופיית שדה בהיר. היא יכולה לעזור לתלמידים לאתר גרעין בתא מרירית הלחי או לבחון את המתאר והסידור של מיקרואורגניזמים. אולם עצם צפייה באובייקט כחול היא תצפית. זיהוי האורגניזם, מדידתו וההחלטה אם הוא מעיד על מחלה הם משימות נפרדות.

תמונת השער ממחישה את עקרון הניגודיות. האטלס שלהלן כולל תצלומים אמיתיים של דגימות שתועדו באופן עצמאי, לצד פרטי המקור שלהן.

מה מתילן כחול חושף?

מתילן כחול הוא צבע בסיסי: היון הצבעוני שלו נושא מטען חיובי. כפי שמסביר OpenStax בדיון שלו בצביעת דגימות, צבעים בסיסיים מגיבים עם חומר תאי בעל מטען שלילי ויכולים להבליט תאים על רקע בהיר יותר. בתכשירים מתאימים, מתילן כחול מדגיש אזורים עשירים בחומצות גרעין ומבנים אחרים הקושרים את הצבע.

בצביעה פשוטה, צבע אחד מספק ניגודיות. לכן אורגניזמים שונים עשויים להיראות כחולים מבלי להיות אותו אורגניזם. בתחילה, השאלות המועילות הן תיאוריות: האם האובייקטים עגולים או מוארכים, מבודדים או מקובצים, צבועים באופן אחיד או בעלי הבדלים פנימיים? עיינו בהבחנה בין צביעה פשוטה לצביעת גראם לפני שתפרשו צבע כתוצאת סיווג.

ניגודיות וכושר הפרדה הם דברים שונים. ניגודיות עוזרת להבחין בין אובייקט לסביבתו; כושר הפרדה מאפשר להבחין בין פרטים סמוכים. תמונה כהה יותר אינה מבטיחה שאפשר להבחין בה ביותר מבנים נפרדים. גם לא כל גרגר כהה ראוי להיקרא אברון.

תכשירים טבעיים, תכשירים רטובים צבועים ומשטחים

תכשיר רטוב לא צבוע, המכונה גם תכשיר טבעי, מאפשר צפייה ללא תוספת צבע, אף שהוצאת הדגימה מסביבתה המקורית עדיין משנה אותה. בתכשיר רטוב צבוע מוסיפים מגיב בעוד החומר נותר בנוזל מתחת לזכוכית כיסוי. במשטח מקובע מפזרים חומר על זכוכית נושא ומשתמשים בשיטת קיבוע מוגדרת לפני שלבי העיבוד הבאים. הסקירה של OpenStax על הכנת תכשירים מבחינה בין תכשירים רטובים לקיבוע ומסבירה מדוע אורגניזמים מקובעים אינם מאפשרים עוד לצפות בתנועה או בחילוף חומרים תקינים.

התכשירים האלה נותנים מענה לשאלות שונות:

לצורך השוואה בכיתה, תעדו תכשיר לא צבוע לפני בחינת תכשיר נפרד שנצבע לפי פרוטוקול ההוראה. הקפידו על תנאי תאורה והגדרות צילום בני השוואה. אם צולמו שני תאים שונים, תארו אותם כדוגמאות, ולא כתיעוד של תא אחד לפני הצביעה ואחריה.

אטלס מיקרוסקופיה: שלוש דגימות צבועות אמיתיות

אטלס זה מציג מבחר מקורי ופרשנות של שלושה תצלומי מיקרוסקופ ברישיון פתוח. מחברי המקורות מציינים את זהות הדגימות ואת הצבעים ששימשו לצביעתן. לא אימתנו באופן עצמאי את זהות הדגימות שלהם. התמונות מובאות ללא חיתוך, לאחר המרה לפורמט WebP ללא אובדן מידע, ללא הוספת פרטים או שינויי צבע.

לוח 1: תאים מרירית לחי אנושית

דגימה: תאים מרירית לחי אנושית. צבע: מתילן כחול. הגדלה: 400×, כפי שדיווח הצלם. סרגל קנה מידה: לא זמין; המקור אינו מספק גודל פיקסל מכויל. צילום של Fritzmann2002, משנת 2017, מתוך תאים מרירית לחי אנושית (צביעה במתילן כחול), ברישיון CC BY-SA 4.0. רישיון זה חל גם על העתק התמונה המוצג כאן.

התחילו בתא מבודד: קל יותר להבחין בגרעין הכהה שלו לעומת הציטופלזמה הכחולה שמסביבו. לאחר מכן בחנו את התאים החופפים שמתחתיו. חפיפה מקשה על המעקב אחר גבול התא ועלולה ליצור אזור כהה יותר בנקודה מסוימת. השתמשו בלוח הזה כדי לתרגל מעקב אחר מתארים, ולא כדי לספור כל כתם כהה כגרעין. המדריך לתצפית בתאי רירית הלחי מרחיב את התרגיל המותאם לדגימה זו.

לוח 2: תאי בצל

דגימה: תאי בצל, לפי הזיהוי במקור. צבע: מתילן כחול. הגדלה: “200x” מופיע בשם הקובץ המקורי; נתון זה לא אומת באופן עצמאי. סרגל קנה מידה: לא זמין; לא סופקו נתוני כיול. צילום של Alvy16, משנת 2019, מתוך תא בצל 200x, ברישיון CC BY 4.0.

המדורים המוארכים יוצרים שכבה מסודרת. השוו את הגבולות הארוכים המשותפים להם עם המתארים הלא סדירים בלוח 1. שימו לב גם לחומר הכהה הבולט ולבהירות הלא אחידה של שדה הראייה. התצלום אינו קובע את זהותו של כל משקע כהה. הוא מדגים מדוע תיעוד תצפית מועיל כולל תוצרי לוואי של ההכנה ואי־ודאות, במקום להצמיד זיהוי לכל דבר שקולט צבע.

לוח 3: שמרים שהמקור זיהה כ־Candida spp.

דגימה: Candida spp., לפי הצלמת. צבע: צביעה חיובית פשוטה במתילן כחול. הגדלה: לא זמינה. סרגל קנה מידה: לא זמין; לא סופק גודל פיקסל מכויל. צילום של Marta, משתמשת ויקימדיה Martunia.g, משנת 2021, מתוך צביעה חיובית במתילן כחול 2, ברישיון CC BY 4.0.

השוו את הצברים הכחולים הצפופים לאזורים הפחות צפופים בשוליים. קל יותר לעקוב אחר מתארים בודדים במקומות שבהם האובייקטים חופפים פחות. השם Candida מקורו בתיעוד המקור, ולא בזיהוי מין שבוצע על סמך התצלום הזה. לוח זה גם אינו מספק תוצאה לגבי חיוּת השמרים. בדיקות חיוּת ונשימה של שמרים דורשות תנאים, בקרות ופרשנות משלהן.

קריאה נכונה של קנה המידה

לוחות אלה מאפשרים השוואה חזותית, לא מדידות במיקרומטרים או השוואות של גודל תאים מוחלט בין הלוחות. נתון ההגדלה המדווח אינו משלים כיול מצלמה חסר. שינוי גודל התצוגה של תמונה משנה את ההגדלה הנראית שלה.

בתמונות שלכם, בצעו כיול מדידה באמצעות תקן ידוע והמערך האופטי הרלוונטי. המדריך של Nikon למיקרומטריה מסביר כיצד מיקרומטר במה ממיר חלוקות שרירותיות בתמונה או ברשת המדידה של העינית לאורכים פיזיים. תעדו את עדשת העצם, תצורת המצלמה והכיול, והוסיפו סרגל קנה מידה על סמך הנתונים האלה. אל תסיקו קנה מידה מגודל תא ממוצע המופיע בספר לימוד.

האם הבקבוק מתאים לשיטה?

בקבוק המסומן כמתילן כחול אינו מפרט מעבדתי מלא. בדקו את הריכוז והיחידות, הממס, מרכיבים נוספים, היישום המיועד, תיעוד האצווה וההוראות. גיליון הבטיחות של מגיב מתאר סיכונים; הוראות השיטה קובעות כיצד להשתמש בו להכנת התכשיר המיועד.

דוגמה קונקרטית היא תמיסת המתילן הכחול של לֶפלר מתוצרת Merck. היצרן מגדיר אותה כמגיב למיקרוסקופיה ומתאר את תפקידה כצבע נגדי בצביעה לעמידות לחומצה. הדליקות המצוינת שלה ממחישה גם מדוע “נוזל כחול” אינו מידע מספיק לתכנון עבודה או חימום. תכונות אלה חלות על ההרכב המסוים הזה, ולא באופן אוטומטי על כל תמיסה מימית של מתילן כחול.

בדומה לכך, אגר אאוזין מתילן כחול הוא מצע גידול בעל הרכב מוגדר. הוא אינו תכשיר צביעה לזכוכית נושא שמכינים על ידי הוספת מתילן כחול בלבד לדגימה. למטרת דימות אחרת, השוו חלופות למתילן כחול למיקרוסקופיה.

בערכת מיקרוסקופ למתחילים, התחילו בשיטת ההוראה המתועדת שלה, בתכשירים מוכנים על זכוכיות נושא שתכולתם ידועה ובמגיב שצוין. אם בקבוק איבד את התווית שלו או שאי אפשר לקבוע את הרכבו, החליפו אותו במגיב המתאים בעל תיעוד. השתמשו בהגנה לעיניים ופעלו לפי הוראות העבודה שסופקו עבור ההרכב שבו אתם משתמשים בפועל. חומר ממקור אנושי ודגימות סביבתיות לא מוכרות מחייבים את נהלי הטיפול בדגימות והסילוק של מעבדת ההוראה; צביעה אינה תחליף לנהלים האלה.

כתבו את התצפית לפני המסקנה

“אובייקטים כחולים סגלגלים בצברים” הוא תיאור של תמונה שאפשר להצדיק. “זיהום מסוים” מחייב ראיות שהתמונה לא סיפקה. תעדו במחברת בנפרד את מקור הדגימה, ההכנה, תגובת הצביעה ושיטת הזיהוי. ההבחנה הזאת הופכת תמונה פשוטה מהכיתה לכלי שימושי ומונעת ייחוס טענה לתצלום מיקרוסקופ מרשים שאינו יכול לתמוך בה.