כיצד מתילן כחול נכנס לתאים: חיזור, חמצון מחדש וחלוקה בין הממברנה לסביבה

כשצופים בצלחת של תאי אנדותל הקולטים מתילן כחול, הפרשנות המתבקשת היא גם הפרשנות השגויה. המדיום מאבד את צבעו הכחול, בתאים מופיעים גרגרים כחולים, ולכן נדמה שחומר הצבע עבר דרך הממברנה כמולקולה הכחולה. הניסויים מראים אחרת. הצורה הכחולה כמעט אינה חוצה את הממברנה. מה שחוצה אותה הוא הצורה חסרת הצבע, והכחול שנראה בפנים נוצר בפנים, לאחר הכניסה.

היפוך התמונה הזה חשוב, משום שהוא קובע מה הצביעה יכולה ומה אינה יכולה ללמד. גרגרים כחולים מעידים על חומר צבע מחומצן שעבר חמצון מחדש ונלכד באברונים. הם אינם מעידים על כלל חומר הצבע שבתא, אינם מעידים על המאגר המחוזר, ואינם מודדים השפעה ביולוגית. כדי להבין מדוע, נעקוב אחר שלושת השלבים: חיזור על פני התא, דיפוזיה של הצורה המחוזרת, וחמצון מחדש ולכידה בפנים.

שתי הצורות מתנהגות כמולקולות שונות

מתילן כחול מחומצן הוא מערכת טבעות שטוחה בעלת מטען חיובי. הוא מתמוסס במים, בולע אור בעוצמה באזור של 600 עד 700 ננומטר, ונראה כחול. המטען הוא העיקר. מולקולה טעונה והידרופילית אינה חוצה בקלות ממברנה ליפידית, ולכן הניסוח הזהיר בספרות הוא שחדירותה דרך הממברנה נמוכה יחסית, ולא שהיא אינה חדירה כלל.

מתילן כחול מחוזר, הנקרא לאוקומתילן כחול, הוא חסר צבע, נטול מטען ומסיס בשומן. כשמסירים את המטען, הממברנה מפסיקה להיות חומה. המולקולה המחוזרת חוצה אותה בקלות בדיפוזיה, וכשהיא נמצאת במדור פנימי שבו הסביבה מחמצנת יותר, היא יכולה לאבד שוב אלקטרונים ולחזור לצורה הכחולה, הטעונה והלכודה. לכן כימיית החמצון־חיזור של חומר הצבע היא גם מנגנון ההעברה שלו. שינוי במספר האלקטרונים משנה את החדירות.

האלקטרונים לשלב הראשון מגיעים מהתא עצמו. תאי יונקים מבצעים העברת אלקטרונים דרך ממברנת הפלזמה, ומעבירים שקולי חיזור מתורמים בתוך התא אל מקבלים על פניו. פעילות זו דרך ממברנת הפלזמה היא תפקוד תאי רגיל, המצוי ברוב סוגי התאים, והרדוקטאז שעל פני תאי האנדותל, הפועל על צבעי תיאזין, דומה לאחרים במאפיין אחד בעל משמעות: הוא ממשיך לפעול בנוכחות ציאניד ואזיד בריכוזים שעוצרים את השלבים המאוחרים יותר. ההפרדה הזאת היא נקודת המפתח של הסיפור כולו.

החלוקה בין פאזות קדמה לכול, וכמעט הסבירה את הקליטה

בשנת 1929 שאלה מריאן ארווין ממכון רוקפלר שאלה פשוטה יותר. אולי כניסת חומר הצבע היא רק חלוקה בין המים לבין השכבות השומניות של התא, ושכבת כלורופורם יכולה לשמש תחליף לשכבות השומניות האלה בניסוי מעבדתי. במסגרת מחקרי החדירה הספקטרופוטומטריים שלה נוערו תמיסות מימיות של חומרי צבע עם כלורופורם, ונערכה השוואה בין החומר שעבר לפאזה האורגנית לבין החומר שנכנס לתאי אצות חיים.

שני ממצאים מאותה עבודה עדיין ראויים לתשומת לב. ראשית, תמיסות מסחריות של מתילן כחול הכילו טרימתיל תיונין, הנקרא כיום Azure B, והזיהום חדר מהר יותר מהמתילן הכחול עצמו, במיוחד ב־pH בסיסי, שבו שולטת צורת הבסיס החופשי המסיסה בליפידים. חלק ממה שנראה ככניסת מתילן כחול היה למעשה כניסה בררנית של Azure B. שנית, ה־pH קבע את התוצאה בכך שקבע את מצב היינון, ותאים פגועים אפשרו כניסה של הרבה יותר חומר צבע מתאים שלמים. מקדמי החלוקה ומצב המטען קבעו מה קלטו המערכת המלאכותית והתא החי, והדמיון ביניהם תמך ברעיון שבגבול התא יש שכבות שאינן מימיות.

המודל הקדים את זמנו בכל הנוגע לליפידים וליינון, אך לא יכול היה להבחין בין חומר צבע שמתחלק בין הפאזות בצורתו המקורית לבין חומר צבע שעובר שינוי כימי על פני התא, חוצה אותו בצורה אחרת, ואז חוזר לצורתו המקורית בפנים. ההבחנה הזאת הצריכה ניסוי אחר, והוא הגיע שבעים שנה מאוחר יותר באנדותל ריאתי.

חיזור בחוץ, לכידה בפנים

מרקר ועמיתיו עבדו עם תאי אנדותל מתורבתים מעורק הריאה של בקר והציעו רצף בן שלושה שלבים: חומר הצבע המחומצן מחוזר על פני התא לצורתו הליפופילית חסרת הצבע, הצורה המחוזרת נכנסת בדיפוזיה, וחמצון מחדש בתוך התא משחזר את הצורה המחומצנת שאינה חדירה דרך הממברנה, וזו מצטברת. לאחר מכן, מחקרם על קליטת צבעי תיאזין באנדותל בחן את הרצף באמצעות ניסיונות לשבש אותו בנקודות מסוימות.

הכלי הראשון היה פריציאניד, מקבל אלקטרונים שאינו יכול להיכנס לתא. כאשר אנזימים על פני התא מחזרים את חומר הצבע הכחול לצורתו חסרת הצבע מחוץ לתא, פריציאניד יכול לקחת ממנו את האלקטרונים בחזרה, וליצור מחדש את חומר הצבע הכחול במדיום עוד לפני שהוא חוצה את הממברנה. כל עוד הפריציאניד היה בעודף (10 מיקרומולר של חומר הצבע לעומת 50 עד 500 מיקרומולר של פריציאניד), קליטת חומר הצבע כמעט נעצרה, ורק לאחר שהפריציאניד נצרך התחדשה הקליטה בקצב הרגיל. הקינטיקה סיפרה את אותו הסיפור בדרך נוספת. הפריציאניד נעלם בקצב כמעט קבוע, בהתאם לשטף חיזור יציב על פני התא המזין מתווך שניתן למחזור, ואילו חומר הצבע שמחוץ לתא נעלם בקצב מעריכי ככל שהמאגר שלו הלך והתרוקן. שטף קבוע לצד מאגר מתרוקן פירושם שהאות של הפריציאניד מעיד על חיזור רציף, ולא על מולקולות צבע העוזבות את התמיסה.

הכלי השני ביטל לחלוטין את שלב חציית הממברנה. הקבוצה חיברה טולואידין כחול O, חומר קרוב ממשפחת התיאזינים, לשרשרת פוליאקרילאמיד גדולה מכדי להיכנס לתא בכל אחד ממצבי החמצון. התאים עדיין חיזרו את חומר הצבע הקשור. לכן חיזור אינו דורש גישה לתוך התא. המנגנון חשוף על פני התא או מצומד אליהם חשמלית.

ואז הגיעה ההפרדה שמעניקה למאמר את כותרתו. ציאניד ואזיד בריכוז של 2 מילימולר דיכאו מאוד את הצטברות חומר הצבע, ובמיקרוסקופ כמעט נעלמו הגופיפים הכחולים־כהים והסגולים שבדרך כלל מקיפים את הגרעין. ובכל זאת, אף אחד מהמעכבים לא האט את החיזור מחוץ לתא: המחזור של הפריציאניד נמשך ללא ירידה, והפולימר שאינו חודר לתא עדיין עבר חיזור. החסימה הייתה בשלב מאוחר יותר. הציאניד והאזיד עצרו את החמצון מחדש ואת הכליאה בתוך התא, ולא את החיזור על פניו. בדיקות הבקרה של חיות התאים תמכו בפרשנות הזאת, שכן התאים שמרו על אנזים הסמן הציטוזולי שלהם, לקטט דהידרוגנאז, במהלך הטיפולים האלה. לכן אובדן הקליטה לא היה רק תוצאה של הרעלה או קרע בממברנה.

הסתייגות אחת מן המאמר עדיין תקפה. הגופיפים הכחולים נמצאו סביב הגרעין אך לא בתוכו, בהתאם לחמצון בתוך אברונים תת־תאיים, אך המחקר לא זיהה באילו אברונים מדובר. דפוסים דומים בסוגי תאים אחרים תוארו כליזוזומליים על בסיס ראיות דלות. יש לראות בלכידה ממצא מבוסס, ובמיקומה המדויק קביעה זמנית. קוראים העוקבים אחר המשך דרכם של האלקטרונים יכולים להמשיך אל העברת אלקטרונים במיטוכונדריה ותהליכי חמצון־חיזור ואל התמונה הרחבה יותר של ספיגה ופיזור לפי דרך המתן.

צביעה אינה חשיפה

מחקר שלישי מראה מה קורה כאשר מנגנון הקליטה הזה פוגש מדד ביולוגי. סקוט ועמיתיו מצאו שמתיל בטא ציקלודקסטרין, מולקולת סוכר דמוית טבעת, קושר מתילן כחול ישירות, עם קבוע אסוציאציה של כ־310 למולר עבור קומפלקס ההכלה, לעומת כ־5846 למולר עבור דימריזציה של חומר הצבע. בפיברובלסטים מסוג L929, הקישור הזה חסם הן את צביעת התאים והן את הגברת קליטת הגלוקוז: הדגרה מקדימה עם הציקלודקסטרין מנעה צביעה כחולה, והוספתו לאחר מכן האיצה את הסרת הצבע. ככל שהאות האופטי הכחול עזב את התאים, ההגברה בהעברת הגלוקוז דעכה במקביל ובתיאום הדוק.

המחברים פירשו את המתאם הזה כתומך באינטראקציה ישירה בין חומר הצבע לבין חלבון במסלול ההפעלה של נשא הגלוקוז, יותר מאשר במנגנון ממושך של עקה חמצונית. ההסקה הזאת סבירה, אך מוגבלת. הניסוי אינו מזהה את החלבון, אינו מראה קישור לנשא עצמו, והמתאם בין הסרת הצבע לאובדן ההשפעה אינו יכול לשלול כל מסלול המתווך באמצעות חמצון־חיזור.

הלקח שנותר תקף נוגע למדידה. צביעה אופטית מעידה על חומר צבע נראה, מחומצן וקשור לתאים. היא אינה מזהה כלל את המאגר המחוזר חסר הצבע, ולכן תא חיוור עדיין יכול להכיל שקולים של חומר הצבע, ותא שנצבע בעוצמה מעיד על חומר צבע מחומצן שנלכד, ולא על החשיפה הכוללת של הרקמה או על גודל ההשפעה. אותה הסתייגות חלה גם בקנה מידה גדול יותר: השוואת צביעה בין סוגי תאים, או התייחסות לחתך רקמה כהה כהוכחה לחשיפה גבוהה יותר, משחזרות את הטעות המקורית בצלחת. הקליטה היא מחזור של חיזור, דיפוזיה וחמצון מחדש, וכל תמונת מצב יחידה של הצורה הכחולה מראה רק חלק אחד ממנו. ההשלכות המעשיות על צביעה וטיפול בחומר במעבדה ועל פרשנות של טענות בנוגע למינון ולחשיפה נובעות מכך ישירות.