Como entra o azul de metileno nas células: redución, reoxidación e captación

Ao observar como unhas células endoteliais captan azul de metileno nunha placa, a interpretación máis evidente é tamén a equivocada. O medio perde a súa cor azul e as células adquiren gránulos azuis, así que o colorante debeu atravesar a membrana como molécula azul. Os experimentos din o contrario. A forma azul apenas a atravesa. A que pasa é a forma incolora, e o azul que se ve no interior fórmase alí, despois da súa chegada.

Esta inversión importa porque determina o que a tinguidura pode indicar e o que non. Os gránulos azuis revelan colorante oxidado que se reoxidou e quedou retido nos orgánulos. Non indican a cantidade total de colorante na célula, non indican a fracción reducida e non miden o efecto biolóxico. Para entender por que, cómpre seguir os tres pasos: redución na superficie, difusión da forma reducida, e reoxidación e retención no interior.

As dúas formas compórtanse como moléculas diferentes

O azul de metileno oxidado é un sistema de aneis plano con carga positiva. Disólvese en auga, absorbe intensamente a luz arredor dos 600 a 700 nanómetros e presenta cor azul. A clave é a carga. Unha molécula con carga e afinidade pola auga non atravesa facilmente unha membrana lipídica, polo que a expresión precisa na literatura é relativamente impermeable á membrana, non impermeable.

O azul de metileno reducido, chamado leucoazul de metileno, é incoloro, carece de carga e é soluble en graxas. Ao eliminar a carga, a membrana deixa de ser unha parede. A molécula reducida difunde facilmente a través dela e, unha vez dentro dun compartimento máis oxidante, pode volver perder electróns e regresar á forma azul, con carga e retida. A química redox do colorante é, polo tanto, tamén o seu mecanismo de transporte. Cambiar o número de electróns cambia a permeabilidade.

Os electróns do primeiro paso proceden da propia célula. As células de mamíferos realizan transporte de electróns a través da membrana plasmática, trasladando equivalentes redutores desde doadores intracelulares cara a aceptores na superficie. Esta actividade transmembrana plasmática é unha función celular normal, presente na maioría dos tipos celulares, e a redutase da superficie endotelial que actúa sobre os colorantes tiazínicos compórtase como outras nun aspecto revelador: segue funcionando en presenza de cianuro e azida a doses que bloquean os pasos posteriores. Esa separación é a clave de toda a explicación.

A partición estudouse primeiro e case explicou a captación

En 1929, Marian Irwin, do Instituto Rockefeller, formulou unha pregunta máis sinxela. Quizais a entrada do colorante sexa simplemente unha partición entre a auga e as capas graxas da célula, e unha capa de cloroformo poida representar esas capas graxas no laboratorio. Nos seus estudos espectrofotométricos de penetración, axitou solucións acuosas de colorantes con cloroformo e comparou o que pasaba á fase orgánica co que entraba nas células vivas de algas.

Dous achados dese traballo aínda merecen atención. Primeiro, as solucións comerciais de azul de metileno contiñan trimetiltionina, hoxe chamada azure B, e esta impureza penetraba máis rápido que o propio azul de metileno, especialmente a pH alcalino, onde predomina a forma de base libre soluble en lípidos. Parte da aparente entrada de azul de metileno era en realidade entrada selectiva de azure B. Segundo, o pH determinaba o resultado ao establecer o estado de ionización, e as células danadas deixaban entrar moito máis colorante que as intactas. Os coeficientes de partición e o estado de carga rexían o que absorbían tanto o sistema artificial como a célula viva, e a semellanza entre ambos apoiaba a idea de capas non acuosas no límite celular.

O modelo anticipou a importancia dos lípidos e da ionización, pero non podía distinguir entre un colorante que se distribúe sen cambiar e outro que se transforma quimicamente na superficie, atravesa baixo outra forma e recupera a forma inicial no interior. Esa distinción requiría un experimento diferente, que chegou setenta anos despois no endotelio pulmonar.

Redución no exterior, retención no interior

Merker e os seus colaboradores traballaron con células endoteliais cultivadas da arteria pulmonar bovina e propuxeron unha secuencia de tres pasos: o colorante oxidado redúcese na superficie celular á súa forma lipófila incolora, a forma reducida difunde cara ao interior e a reoxidación intracelular rexenera a forma oxidada impermeable á membrana, que se acumula. O seu estudo sobre a captación endotelial de colorantes tiazínicos puxo despois a proba esa secuencia intentando interrompela en puntos concretos.

A primeira ferramenta foi o ferricianuro, un aceptor de electróns que non pode entrar na célula. Cando os encimas da superficie reducen o colorante azul á súa forma incolora fóra da célula, o ferricianuro pode recuperar eses electróns e rexenerar o colorante azul no medio antes de que chegue a atravesar a membrana. Mentres o ferricianuro estaba presente en exceso (colorante a 10 micromolar fronte a ferricianuro de 50 a 500 micromolar), a captación do colorante case se detiña, e só despois de consumirse o ferricianuro se retomaba á súa velocidade normal. A cinética corroborou a mesma explicación doutra maneira. O ferricianuro desaparecía a unha velocidade aproximadamente constante, compatible cun fluxo estable de redución superficial que alimentaba un mediador reciclable, mentres que o colorante extracelular desaparecía exponencialmente a medida que se esgotaba a súa reserva. Un fluxo constante xunto cunha reserva que se esgota significa que o sinal do ferricianuro indica unha redución continua, non moléculas de colorante que abandonan a solución.

A segunda ferramenta eliminou por completo o paso de atravesar a membrana. O grupo uniu azul de toluidina O, un colorante tiazínico estreitamente relacionado, a unha gran cadea de poliacrilamida, demasiado grande para entrar na célula en calquera dos dous estados de oxidación. As células seguían reducindo o colorante unido á cadea. A redución, polo tanto, non precisa acceso ao interior celular. A maquinaria está exposta na superficie ou acoplada electricamente a ela.

Despois chegou a separación que dá título ao artigo científico. O cianuro e a azida a 2 millimolar suprimían intensamente a acumulación do colorante e, ao microscopio, as inclusións azul escuro e púrpura que normalmente rodean o núcleo case desaparecían. Porén, ningún dos dous inhibidores ralentizaba a redución extracelular: o ciclo do ferricianuro continuaba sen diminuír e o polímero non permeante seguía reducíndose. O bloqueo estaba nun paso posterior. O cianuro e a azida detiñan a reoxidación e o secuestro intracelulares, non a redución superficial. Os controis de viabilidade apoiaban esta interpretación, xa que as células conservaban o seu encima marcador citosólico, a lactato deshidroxenase, durante estes tratamentos; así, a perda de captación non se debía simplemente a toxicidade ou rotura da membrana.

Unha advertencia do artigo segue sendo pertinente. As inclusións azuis situábanse arredor do núcleo, pero non dentro del, o que era compatible coa oxidación no interior de orgánulos subcelulares; porén, o estudo non identificou cales. Patróns similares noutros tipos celulares foran atribuídos aos lisosomas con escasas probas. Cómpre considerar a retención como demostrada e a súa localización como provisional. Quen queira seguir o percorrido posterior dos electróns pode continuar coa lectura sobre o transporte mitocondrial de electróns e a xestión redox e a visión máis ampla da absorción e distribución segundo a vía.

A tinguidura non é a exposición

Un terceiro estudo mostra o que ocorre cando esta lóxica de captación se relaciona cunha medida biolóxica. Scott e os seus colaboradores observaron que a metil-beta-ciclodextrina, un azucre con forma de anel toroidal, se une directamente ao azul de metileno, cunha constante de asociación arredor de 310 por molar para o complexo de inclusión, fronte a uns 5846 por molar para a dimerización do colorante. En fibroblastos L929, esta unión bloqueou tanto a tinguidura celular como a estimulación da captación de glicosa: a preincubación coa ciclodextrina impedía a tinguidura azul, e engadila despois aceleraba a perda de tinguidura. A medida que o sinal óptico azul desaparecía das células, a activación do transporte de glicosa diminuía nun estreito paralelismo.

Os autores interpretaron esta correlación como un indicio a favor dunha interacción directa entre o colorante e unha proteína da vía de activación do transportador de glicosa, fronte a un mecanismo de estrés oxidativo prolongado. Esa inferencia é razoable, pero ten límites. O experimento non identifica a proteína, non demostra a unión ao propio transportador e a correlación entre a perda de tinguidura e a perda do efecto non pode excluír todas as vías mediadas por procesos redox.

A lección que perdura ten que ver coa medición. A tinguidura óptica indica colorante visible, oxidado e asociado ás células. Non detecta en absoluto a fracción reducida incolora, polo que unha célula pálida aínda pode conter equivalentes de colorante, e unha célula intensamente tinguida indica colorante oxidado retido, non a exposición tisular total nin a magnitude do efecto. A mesma cautela aplícase a maior escala: comparar a tinguidura entre tipos celulares ou considerar unha sección de tecido escura como proba dunha exposición maior repite o erro inicial da placa. A captación é un ciclo de redución, difusión e reoxidación, e calquera instantánea da forma azul só mostra unha parte del. As consecuencias prácticas para a tinguidura e a manipulación no laboratorio e para interpretar as afirmacións sobre dose e exposición despréndense directamente disto.