Azul de metileno e leucoazul de metileno: un par redox, dúas cores

Unha estudante engade unhas gotas de colorante azul a un matraz, axítao suavemente e observa como desaparece a cor. Axita o matraz con forza e o azul reaparece. Entre os dous estados non se engadiu nin se retirou nada, salvo electróns e contacto co aire. Ese matraz contén todo o tema deste artigo: o azul de metileno e a súa forma reducida, o leucoazul de metileno, que se interconverten nun par redox reversible no que a cor é o sinal de lectura.

O aspecto práctico vai primeiro. Aquí o cambio de cor non é un efecto secundario. É o sinal analítico. Calquera persoa que formule con azul de metileno, o empregue en valoracións ou ensine con el debería poder escribir a semirreacción de memoria, indicar as condicións que a desprazan cara á esquerda ou á dereita e nomear as impurezas que dificultan a interpretación do resultado.

O par nunha ecuación

O azul de metileno oxidado é o catión metiltioninio: un sistema plano de fenotiazinio con xofre e nitróxeno no anel central e un grupo dimetilamino en cada extremo, subministrado como sal cloruro. PubChem rexístrao como cloruro de metiltioninio, C.I. Basic Blue 9. En auga, o monómero absorbe preto de 664 nm, o que produce o azul que percibe o ollo.

O leucoazul de metileno reducido (LMB) ten o mesmo esqueleto, co nitróxeno do anel central protonado e o cromóforo interrompido. Non ten carga a un pH próximo ao neutro e é case incoloro, cunha absorbancia visible desprezable e unha banda ultravioleta intensa preto de 258 nm (entrada de PubChem para o leucoazul de metileno, CAS 613-11-6). O número de protóns na semirreacción depende do pH, porque a forma reducida se protona en medio ácido (valores aproximados de pKa próximos a 4.5 e 5.8). Tres réximes cobren o intervalo práctico:

MB(+) + 2 e(-) + H(+) <=> LMB, azul <=> incoloro (pH próximo ao neutro, 1 protón)

MB(+) + 2 e(-) + 2 H(+) <=> LMBH(+), azul <=> incoloro (moderadamente ácido, 2 protóns)

MB(+) + 2 e(-) + 3 H(+) <=> especie leuco dobremente protonada (fortemente ácido, 3 protóns)

As tres expresións describen o mesmo par en distintos estados de protonación, un aspecto que a bibliografía sobre o comportamento redox dos colorantes de tiazina trata de maneira sistemática. A dependencia do pH segue a ecuación de Nernst para Ox + mH(+) + 2e(-) <=> Red, que dá unha pendente de arredor de 29.6, 59.2 ou 88.7 mV por unidade de pH para m = 1, 2 ou 3. As pendentes medidas, próximas a 28, 58 e 87 mV por unidade de pH, confirman esta asignación, polo que un potencial comunicado sen indicar o seu pH carece de sentido.

O que a ecuación lle di a quen formula

Da estequiometría despréndense tres feitos. Primeiro, dous electróns por molécula significan que o azul de metileno é un indicador e mediador de dous electróns, non un transportador dun só electrón, na súa reacción neta. Segundo, participan protóns, polo que o potencial formal varía co pH tal como se describiu antes. Terceiro, o potencial formal a pH 7 sitúase preto de +0.011 V respecto do eléctrodo estándar de hidróxeno (arredor de +0.53 V a pH 0), o que sitúa o par entre os oxidantes suaves: suficientemente forte para aceptar electróns de bos doadores como o NAD(P)H ou o ascorbato, e suficientemente débil para cedelos ao osíxeno disolto ou a centros férricos. Esa posición intermedia é precisamente a razón pola que o colorante alterna entre as dúas formas en lugar de quedar atrapado nun extremo.

A concentración engade outra complicación. Por riba de aproximadamente cen micromolar en auga, en consonancia cunha constante de disociación monómero-dímero publicada de arredor de 170 a 250 uM a pH 7, o catión oxidado apílase formando dímeros e agregados de maior tamaño, cunha banda de absorción desprazada a preto de 610 a 615 nm. Un espectro cun máximo aparentemente desprazado pode, polo tanto, indicar agregación, non impurezas. Primeiro dilúe; despois avalía.

Condicións que favorecen cada sentido

A táboa seguinte serve de referencia para o traballo de laboratorio. A redución necesita un doador de electróns; a reoxidación necesita un aceptor de electróns, e normalmente abonda co aire.

Cada entrada obedece á mesma ecuación. Só cambia a forza impulsora. Nese sentido, o par é reversible: o camiño é o mesmo, percorrido en sentidos opostos baixo condicións opostas.

A botella azul, explicada

O mecanismo desta demostración merece unha explicación clara porque representa o par en miniatura. Nunha disolución alcalina de glicosa, a base favorece a enolización da glicosa e o enediolato resultante reduce o azul de metileno a leucoazul de metileno, polo que o contido do matraz se volve incoloro. A axitación disolve osíxeno do espazo de cabeza, o osíxeno reoxida a forma leuco e o azul reaparece. En repouso, esgótase o osíxeno disolto preto da zona de reacción superficial e a glicosa volve predominar. O ciclo repítese ata que se consome a glicosa, e cada axitación é unha ecuación de Nernst visible: ao aumentar a actividade do oxidante, o equilibrio desprázase cara ao azul.

O radical intermedio

A reacción neta transfire dous electróns, pero as etapas elementais transfiren un cada vez. Entre o catión azul e a forma leuco incolora hai un intermediario radicalario semiquinónico que, na súa maior parte, se desproporciona para rexenerar o par en lugar de acumularse. O seu potencial dun electrón, próximo a menos 0.23 V a pH 7, está moi por debaixo do potencial medio neto de dous electróns, polo que o radical se mantén como unha especie minoritaria en estado estacionario. É importante por dúas razóns. Baixo iluminación, o colorante alcanza estados excitados que abren vías radicalarias; por iso as disolucións de azul de metileno son sensibles á luz e a fotoquímica debe formar parte de calquera protocolo de estabilidade. Ademais, a concentracións altas, a forma oxidada dimeriza, o que cambia o espectro e a cinética aparente sen modificar o par subxacente. Ningún dos dous feitos rompe a reversibilidade. Ambos explican observacións que, doutro xeito, parecen indicar irreversibilidade.

Os compostos relacionados desmetilados desprazan a escala

Ao eliminar grupos metilo dos dous brazos dimetilamino, o par mantense, pero as súas propiedades cambian. O máximo de absorción desprázase de maneira monótona cara ao azul con cada desmetilación: azul de metileno preto de 664 nm, Azure B preto de 654, Azure A preto de 630, Azure C preto de 615 e tionina preto de 600 nm. Azure B, ao que lle falta un grupo metilo, é o composto máis próximo: un metabolito principal do azul de metileno e unha impureza documentada no material de azul de metileno. Azure A e Azure C continúan a serie co mesmo esqueleto activo en reaccións redox. A tionina, cos dous grupos amino completamente desmetilados, sitúase no extremo cun potencial formal próximo a +0.06 V a pH 7, fronte ao azul de metileno a +0.011 V, polo que se reduce con bastante máis facilidade. Os potenciais redox da serie dependen do medio e do eléctrodo, así que só se deben comparar valores obtidos baixo as mesmas condicións. Por iso, caracterizar as impurezas é unha cuestión redox, non só un requisito de pureza que marcar nunha lista. Unhas poucas unidades porcentuais de Azure B significan unhas poucas unidades porcentuais dun par redox distinto na botella, e Azure B como impureza e metabolito documenta como se controla esa fracción.

Onde entra a bioloxía

Dentro dun glóbulo vermello, o NADPH reduce o azul de metileno a leucoazul de metileno, e a forma leuco transfire electróns ao ferro férrico do grupo hemo, restablecendo o estado ferroso da hemoglobina. Ese relevo electrónico é a base química do uso do azul de metileno na metahemoglobinemia adquirida. Todo o que sucede despois dese relevo, o metabolismo enerxético, o fluxo electrónico mitocondrial e calquera resultado biolóxico, corresponde ao transporte electrónico mitocondrial e déixase deliberadamente para ese artigo.

Compra o par, non só a cor

A calidade dun colorante redox depende da súa especificación. A alta pureza importa porque o azul de metileno que non cumpre a USP adoita ser de grao téxtil e conter Azure B, metais pesados ou disolventes residuais que alteran as lecturas redox e fan menos nítidos os puntos finais, sen que ningún protocolo de tinguidura os detecte. A maioría dos vendedores que afirman cumprir a USP só analizan os metais pesados e dan o traballo por rematado. A conformidade completa abrangue identidade, valoración do contido, impurezas orgánicas, disolventes residuais, impurezas elementais, residuo de ignición, límites microbianos e endotoxinas bacterianas, e como elixir azul de metileno de grao farmacéutico explica como ler esa documentación. Blupreme traballa cun fabricante farmacéutico de azul de metileno, verifica mediante análises a especificación completa da USP e publica o COA completo. Cando a cor é a medida, esa documentación forma parte do instrumento.