Comment le bleu de méthylène entre dans les cellules : réduction, réoxydation et partition membranaire

Observez une boîte de cellules endothéliales absorber du bleu de méthylène : l’interprétation la plus évidente est aussi la mauvaise. Le milieu perd sa couleur bleue, les cellules acquièrent des granules bleus ; on pourrait donc penser que le colorant a traversé la membrane sous la forme de la molécule bleue. Les expériences montrent le contraire. La forme bleue traverse à peine. C’est la forme incolore qui passe, et le bleu visible à l’intérieur est produit sur place, après son entrée.

Cette inversion est importante, car elle détermine ce que la coloration peut ou ne peut pas révéler. Les granules bleus signalent un colorant oxydé qui a été réoxydé et piégé dans des organites. Ils ne renseignent ni sur la quantité totale de colorant dans la cellule, ni sur le pool réduit, et ne mesurent pas l’effet biologique. Pour comprendre pourquoi, il faut suivre trois étapes : réduction à la surface, diffusion de la forme réduite, puis réoxydation et piégeage à l’intérieur.

Les deux formes se comportent comme des molécules différentes

Le bleu de méthylène oxydé est un système cyclique plat chargé positivement. Il se dissout dans l’eau, absorbe fortement la lumière autour de 600 à 700 nanometers et paraît bleu. La charge est l’élément déterminant. Une molécule chargée et hydrophile ne traverse pas facilement une membrane lipidique ; la formulation prudente employée dans la littérature est donc relativement imperméable à la membrane, et non imperméable.

Le bleu de méthylène réduit, appelé leucométhylène bleu, est incolore, non chargé et liposoluble. Supprimez la charge et la membrane cesse d’être une barrière. La molécule réduite diffuse facilement à travers elle et, une fois dans un compartiment plus oxydant, elle peut à nouveau perdre des électrons et revenir à la forme bleue, chargée et piégée. La chimie redox du colorant constitue donc également son mécanisme de transport. Modifier le nombre d’électrons revient à modifier la perméabilité.

Les électrons nécessaires à la première étape proviennent de la cellule elle-même. Les cellules de mammifères assurent un transport d’électrons à travers la membrane plasmique, transférant des équivalents réducteurs depuis des donneurs intracellulaires vers des accepteurs situés à la surface. Cette activité transmembranaire est une fonction cellulaire normale, présente dans la plupart des types cellulaires, et la réductase de surface endothéliale qui prend en charge les colorants thiaziniques se comporte comme d’autres réductases sur un point révélateur : elle continue à fonctionner en présence de cyanure et d’azoture à des doses qui bloquent les étapes ultérieures. Cette dissociation constitue le pivot de toute l’histoire.

La partition est venue en premier et a presque expliqué l’absorption

En 1929, Marian Irwin, au Rockefeller Institute, a posé une question plus simple. Peut-être l’entrée du colorant n’est-elle qu’un phénomène de partition entre l’eau et les couches lipidiques de la cellule, auquel cas une couche de chloroforme peut représenter ces couches lipidiques sur la paillasse. Dans ses études spectrophotométriques de pénétration, elle a agité des solutions aqueuses de colorant avec du chloroforme et comparé ce qui passait dans la phase organique à ce qui pénétrait dans des cellules vivantes d’algues.

Deux résultats de ce travail méritent encore l’attention. Premièrement, les solutions commerciales de bleu de méthylène contenaient de la triméthylthionine, aujourd’hui appelée Azure B, et cette impureté pénétrait plus rapidement que le bleu de méthylène lui-même, en particulier à pH alcalin où prédomine la forme base libre liposoluble. Une partie de ce qui semblait être une entrée de bleu de méthylène correspondait en réalité à l’entrée sélective d’Azure B. Deuxièmement, le pH déterminait le résultat en déterminant l’état d’ionisation, et les cellules lésées laissaient entrer beaucoup plus de colorant que les cellules intactes. Les coefficients de partition et l’état de charge gouvernaient ce que le système artificiel et la cellule vivante absorbaient chacun, et la ressemblance entre les deux étayait l’idée de couches non aqueuses dans la limite cellulaire.

Le modèle était précurseur concernant le rôle des lipides et de l’ionisation, mais il ne pouvait pas distinguer un colorant qui se répartit tel quel d’un colorant chimiquement converti à la surface, qui traverse sous une autre forme puis est reconverti à l’intérieur. Cette distinction exigeait une autre expérience, arrivée soixante-dix ans plus tard dans l’endothélium pulmonaire.

Réduction à l’extérieur, piégeage à l’intérieur

Merker et ses collègues ont travaillé sur des cellules endothéliales d’artère pulmonaire bovine en culture et proposé une séquence en trois étapes : le colorant oxydé est réduit à la surface cellulaire en sa forme lipophile incolore, la forme réduite diffuse vers l’intérieur, puis la réoxydation intracellulaire régénère la forme oxydée imperméable à la membrane, qui s’accumule. Leur étude de l’absorption endothéliale des thiazines a ensuite testé cette séquence en cherchant à l’interrompre à des endroits précis.

Le premier outil était le ferricyanure, un accepteur d’électrons qui ne peut pas pénétrer dans la cellule. Lorsque les enzymes de surface réduisent le colorant bleu en sa forme incolore à l’extérieur de la cellule, le ferricyanure peut reprendre ces électrons, régénérant le colorant bleu dans le milieu avant qu’il ne traverse. Tant que le ferricyanure était présent en excès (10 micromolar de colorant contre 50 à 500 micromolar de ferricyanure), l’absorption du colorant cessait presque, et ce n’est qu’après consommation du ferricyanure que l’absorption reprenait à son rythme normal. La cinétique racontait la même histoire d’une deuxième manière. Le ferricyanure disparaissait à un rythme approximativement constant, compatible avec un flux régulier de réduction à la surface alimentant un médiateur recyclable, tandis que le colorant extracellulaire disparaissait de façon exponentielle à mesure que son pool s’épuisait. Un flux constant associé à un pool qui se vide signifie que le signal du ferricyanure reflète une réduction continue, et non la disparition de molécules de colorant de la solution.

Le deuxième outil supprimait entièrement l’étape de traversée. Le groupe a fixé du bleu de toluidine O, un proche parent de la famille des thiazines, sur une grande chaîne de polyacrylamide trop volumineuse pour pénétrer dans la cellule quel que soit son état d’oxydation. Les cellules réduisaient néanmoins le colorant ainsi immobilisé. La réduction ne nécessite donc aucun accès intracellulaire. La machinerie est exposée à la surface ou lui est couplée électriquement.

Vint ensuite la dissociation qui donne son titre à l’article. Le cyanure et l’azoture à 2 millimolar réduisaient fortement l’accumulation du colorant et, au microscope, les inclusions bleu foncé et violettes qui entourent normalement le noyau avaient presque disparu. Pourtant, aucun des deux inhibiteurs ne ralentissait la réduction extracellulaire : le cycle du ferricyanure se poursuivait sans diminution et le colorant polymérique non pénétrant était toujours réduit. Le blocage se situait en aval. Le cyanure et l’azoture empêchaient la réoxydation et la séquestration intracellulaires, et non la réduction à la surface. Les contrôles de viabilité confirmaient cette interprétation, puisque les cellules conservaient leur enzyme marqueur cytosolique, la lactate déshydrogénase, pendant ces traitements ; la perte d’absorption ne résultait donc pas simplement d’un empoisonnement ou d’une rupture membranaire.

Une réserve formulée dans l’article reste valable. Les inclusions bleues étaient disposées autour du noyau, mais pas à l’intérieur, ce qui est compatible avec une oxydation dans des organites subcellulaires ; cependant, l’étude n’a pas identifié lesquels. Des motifs similaires observés dans d’autres types cellulaires avaient été qualifiés de lysosomaux sur la base de données limitées. Il faut donc considérer le piégeage comme établi, mais sa localisation précise comme provisoire. Les lecteurs qui souhaitent suivre le devenir ultérieur des électrons peuvent poursuivre avec le transport mitochondrial des électrons et la gestion redox ainsi qu’avec la vue d’ensemble de l’absorption et de la distribution selon la voie d’administration.

La coloration ne mesure pas l’exposition

Une troisième étude montre ce qui se produit lorsque cette logique d’absorption rencontre une mesure biologique. Scott et ses collègues ont constaté que la méthyl-bêta-cyclodextrine, un tore de sucre en forme d’anneau, se lie directement au bleu de méthylène, avec une constante d’association d’environ 310 per molar pour le complexe d’inclusion contre environ 5846 per molar pour la dimérisation du colorant. Dans des fibroblastes L929, cette liaison bloquait à la fois la coloration cellulaire et la stimulation de l’absorption du glucose : une préincubation avec la cyclodextrine empêchait la coloration bleue, et son ajout ultérieur accélérait la décoloration. À mesure que le signal optique bleu quittait les cellules, le transport activé du glucose diminuait en parallèle étroit.

Les auteurs ont interprété cette corrélation comme favorisant l’hypothèse d’une interaction directe entre le colorant et une protéine de la voie d’activation du transporteur de glucose, plutôt qu’un mécanisme de stress oxydatif prolongé. Cette inférence est raisonnable, mais limitée. L’expérience n’identifie pas la protéine, ne démontre pas une liaison au transporteur lui-même, et la corrélation entre la décoloration et la perte d’effet ne permet pas d’exclure toutes les voies médiées par le redox.

La leçon durable concerne la mesure. La coloration optique indique la présence de colorant visible, oxydé et associé aux cellules. Elle ne détecte absolument pas le pool réduit incolore ; une cellule pâle peut donc encore contenir des équivalents de colorant, tandis qu’une cellule intensément colorée signale du colorant oxydé piégé plutôt que l’exposition tissulaire totale ou l’ampleur de l’effet. La même prudence s’applique à plus grande échelle : comparer la coloration entre différents types cellulaires, ou considérer une coupe tissulaire sombre comme la preuve d’une exposition plus élevée, revient à répéter l’erreur initiale faite avec la boîte de culture. L’absorption est un cycle de réduction, de diffusion et de réoxydation, et tout instantané isolé de la forme bleue n’en montre qu’une partie. Les conséquences pratiques pour la coloration et la manipulation en laboratoire ainsi que pour l’interprétation des affirmations relatives à la dose et à l’exposition en découlent directement.