Metyleenisinisen historia: väriaineesta lääkkeeksi ja tutkimukseen

Metyleenisininen päätyi potilaalle ennen kuin se päätyi apteekkiin.

Paul Guttmannin ja Paul Ehrlichin vuoden 1891 raportti väriaineen käytöstä malariassa sisältää kaksi lämpötilakaaviota. Toinen kattaa ajan 13 July to 5 August, ja hoito on merkitty reunukseen päivä päivältä. Päivien 18 and 19 July kohdalla lukee "1 × 0,05 Methylenblau". Seuraaville päiville on merkitty viisi ja seitsemän samansuuruista annosta, ja 22 July mennessä tietoihin on lisätty pieni määrä kiniiniä. Kuumekäyrä, joka vaihtelee kaavion ensimmäisellä puoliskolla välillä 37 °C and 39.5 °C, tasaantuu väriaineen käyttöönoton jälkeen ja pysyy jäljellä olevat kolme viikkoa noin välillä 36 °C and 37.5 °C.

Potilas oli toinen kahdesta henkilöstä, joita artikkelissa kuvataan kotiapulaiseksi ja merimieheksi. Heille annettu yhdiste oli ollut kaupallinen tekstiiliväri viisitoista vuotta, ja nämä kaksi miestä kuuluvat ensimmäisiin kirjattuihin henkilöihin, joita hoidettiin täysin synteettisellä, tiettyyn organismiin kohdistetulla lääkkeellä.

Väriaine tuli ensin

Ensimmäisen kaupallisesti menestyneen synteettisen väriaineen loi William Henry Perkin vuonna 1856. Perkin oli kahdeksantoistavuotias, työskenteli kotilaboratoriossa pääsiäisloman aikana ja yritti syntetisoida kiniiniä. Sen sijaan hän sai mustan jäännöksen, liuotti sen ja löysi värin, joka kiinnittyi silkkikankaaseen poikkeuksellisen hyvin. Hän patentoi sen August 1856, ja vuoden 1857 loppuun mennessä hänen tehtaansa toimitti väriainetta lontoolaiselle silkkivärjäämölle.

Vuonna 1875 Adolf von Baeyer syntetisoi punaisen väriaineen ja nimesi sen eosiiniksi kreikan aamunkoittoa tarkoittavan Eos-sanan mukaan. Vuonna 1876 Heinrich Caro, joka toimi tuolloin Badische Anilin- und Soda-Fabrikin laboratorion johtajana, kehitti yhdessä Baeyerin kanssa metyleenisinisen aniliinipohjaiseksi puuvillan väriaineeksi. Sen kemiallinen rakenne saatiin selvitettyä vasta noin yhdeksän vuotta myöhemmin.

Tämä alkuperä näkyy edelleen aineen nimessä. "Metyleenisininen" on väriainekuvastosta peräisin oleva kauppanimi, ei kemiallinen kuvaus. Nimi viittaa metyylitioniinikloridiin, ja nimen, suolan ja sen hydraattien välisillä eroilla on merkitystä heti, kun materiaalia punnitaan tai spesifikaatiota luetaan.

Värjäys toimi siltana

Reitti väritehtaasta sairaalaan kulki mikroskoopin kautta, ja se alkoi jo ennen metyleenisinisen olemassaoloa. Wilhelm Erb käytti ensimmäisenä synteettistä väriainetta veren värjäämiseen käyttäessään pikriinihappoa vuonna 1865 ja havaitsi joidenkin punasolujen sisällä verkkomaisen kuvion.

Paul Ehrlichin vuoden 1878 väitöskirjassa verrattiin histologista värjäystä tekstiilien värjäämiseen ja esitettiin, että molemmat olivat kemiallisia reaktioita. Työskennellessään Robert Kochin alaisuudessa tuberkuloosibasillin parissa hän jakoi aniliinivärit happamiin ja emäksisiin luokkiin ja osoitti, että kumpikin luokka värjäsi solun eri osia. Vuonna 1880 hän sekoitti nämä kaksi yhteen: kyllästettyä metyleenisiniliuosta kaadettiin happamaan fuksiiniin, kunnes päällä oleva liuos kirkastui. Tulos, jota hän kutsui nimellä neutralen Farbkörper eli neutraali väriaine, tuotti yhden värin sijasta kolme, paljasti polymorfonukleaarisissa soluissa rakeita, joita ei ollut aiemmin voitu nähdä, ja mahdollisti ensimmäisen leukosyyttien erittelylaskennan. Koska nämä rakeet sitoivat seoksen molempia komponentteja, Ehrlich loi niitä sisältäville soluille nimityksen neutrofiili.

Kaksi vuotta myöhemmin Koch käytti metyleenisinistä tuberkuloosibasillin löytämiseen, ja vuonna 1883 Ehrlich paransi menetelmää. Vuonna 1886 hän julkaisi toisenlaisen havainnon: hän ruiskutti väriainetta eläviin eläimiin, vertasi sen kertymistä eri elimiin ja päätteli, että sillä oli selvä affiniteetti aivo- ja hermokudokseen. Hän yhdisti tämän affiniteetin väriaineen hapetus-pelkistyskiertoon, jonka hän oli havainnut edellisenä vuonna. Sama kierto selittää myös sen, miksi metyleenisiniliuos menettää värinsä hapen kuluessa loppuun ja saa sen takaisin ilman palatessa. Kokeet, joissa tämän kierron seurauksia mitattiin ensimmäisen kerran, kuuluvat myöhemmälle vuosikymmenelle, ja itse mekanismi on historiasta erillinen aihe.

Loinen ja violetti tuma

Alphonse Laveran löysi malarialoisen vuonna 1880 tutkimalla tuoretta, värjäämätöntä verta. Sen rutiininomainen havaitseminen kuivatusta sivelyvalmisteesta vaati värjäystä, ja tuon ajan värjäykset tuottivat vain punaista ja sinistä.

Vuonna 1888 puolalainen patologi Czesław Cheçinski korvasi happaman fuksiinin eosiinilla ja loi metyleenisinisestä ja eosiinista koostuvan seoksen. Hänen menetelmänsä taustalla ollut tapaus koski sotilasta, joka oli kuollut malariaan 30 September 1887. Verisivelyissä Cheçinski näki sinisiä päivänkakkaraa muistuttavia muotoja, jotka nykyisin tunnistetaan lajiksi Plasmodium malariae, sekä sirpinmuotoisia rakenteita, jotka nykyisin tunnistetaan Plasmodium falciparum -lajin gametosyyteiksi. Tulos kumosi kerralla kaksi kilpailevaa selitystä sairaudelle: miasmateorian sekä Edwin Klebsin ja Corrado Tommasi-Crudelin väitteen, jonka mukaan malariaa aiheutti bakteeri.

Loinen oli näkyvissä. Sen tuma ei ollut, joten sen luonne jäi avoimeksi. Breslaussa toiminut lääkäri Ernst Malachowski ratkaisi ongelman ensin vahingossa ja sitten tarkoituksellisesti. Hän havaitsi vuonna 1889 valmisteessa plasmodiumin tuman erilaistuvan värjäytymisen mutta ei onnistunut toistamaan tulosta. Metyleenisinisen happamoittaminen ei auttanut. Sen alkalisoiminen booraksilla tuotti vaikutuksen joka kerta. Hän esitteli tekniikan julkisesti 15 June 1890 ja julkaisi sen samana vuonna sekä yksityiskohtaisemman menetelmän August 1891.

Dmitri Romanowsky julkaisi oman versionsa September 1891. Hänen parhaat tuloksensa saatiin laiminlyödystä, homehtuneesta metyleenisiniliuospullosta, joka oli yli kaksi kuukautta vanha. Malachowskin kuvaus oli tarkoituksellinen ja hänen omien sanojensa mukaan helposti toistettavissa; Romanowskyn menetelmä oli umpikuja, joka toimi kerran. Eponyymi päätyi silti Romanowskylle, ja kiista siitä, kuka tuotti tuman näkyväksi tehneen violetin värin on oma tarinansa omine asiakirjoineen.

Kuva: Guttmannin ja Ehrlichin vuoden 1891 raportin toinen lämpötilakaavio. Ylempi paneeli kattaa ajan 13 to 24 July ja alempi 25 July to 5 August; reunusmerkinnöissä ilmoitetaan annetut annokset, ja lämpötila pysyy lähellä normaalia tietueen viimeiset kolme viikkoa. Jäljennetty raportista Kraftsin, Hempelmannin ja Skórska-Stanian artikkelia varten skannatusta versiosta, Parasitology Research* 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Kypsyminen osoittautui demetylaatioksi

Kukaan 1890-luvulla mukana olleista ei tiennyt, mitä "kypsyminen" teki metyleenisiniselle. Vastaus löytyi teollisuuskemiasta. Heinrich August Bernthsen oli syntetisoinut kantayhdisteen fenotiatsiinin vuonna 1883, osoittanut vuonna 1885 metyleenisinisen kuuluvan tähän ryhmään ja osoittanut samalla ajanjaksolla, että emäksiset olosuhteet irrottavat väriaineesta metyyliryhmiä ja tuottavat yhdisteitä, joita nykyisin kutsutaan atsuuriväreiksi.

Bernard Nocht eristi aktiivisen fraktion vuosina 1898 and 1899 ja pystyi kutsumaan sitä vain nimellä Rot aus Methylenblau, punaista metyleenisinisestä. Michaelis tunnisti sen azure I:ksi vuonna 1901. Jenner otti vuonna 1899 käyttöön absoluuttisen metanolin värisaostuman liuottimena, mikä poisti verisivelyiden lämpökiinnityksen tarpeen; Leishman ja Reuter yhdistivät molemmat edistysaskeleet; Wright julkaisi yksinkertaistetun menetelmän vuonna 1902. Giemsan panos, myös vuonna 1902, oli luopua satunnaisesti kypsyneen liuoksen käytöstä ja käyttää sen sijaan mitattuja määriä tunnettuja väriaineita. Tämän jälkeen hän kieltäytyi julkaisemasta, miten puhdasta metyleeniatsuuria valmistettiin, ja myi menetelmän Dr. Grüblerin laboratoriolle, joka markkinoi tuotetta nimellä azure I ja väitti, että vain sen versio oli aitoa Giemsa-värjäystä.

Kaksi maailmansotaa saattoi työn vahingossa päätökseen. Kun saksalaisia väriaineita ei enää ollut saatavilla, Lillie, Roe ja Wilcox tutkivat amerikkalaisia korvikkeita ja havaitsivat, että paras värjäystulos saatiin kolmesta erotetusta komponentista: puhtaasta metyleenisinisestä, sen hajoamistuotteesta azure B, ja eosiinista. Nämä kolme ovat edelleen nykyään malarian diagnostiikassa käytettävän värjäyksen tärkeimmät komponentit nimellä, joka yhdistää Malachowskin, Wrightin ja Giemsan.

Kuva: Plasmodium falciparum* -lajin rengasmuotoja ihmisen punasoluissa Romanowsky-tyyppisellä menetelmällä värjättyinä. Renkaan sisällä oleva violetti rakenne on kromatiini, jonka Malachowskin booraksilla käsitelty metyleenisininen teki ensimmäistä kertaa näkyväksi. Kuva: Ernst Hempelmann, julkaistu public domain -aineistona.

Yksi nimi, useita materiaaleja

Näiden komponenttien erottamiseen kuluneet vuodet jättivät ongelman, joka säilyi pidempään kuin itse kemiallinen epäselvyys. Ralph Lillie teki vuonna 1969 eron biologisten väriaineiden, jotka "valmistettiin tiukkojen, niiden vaativien ja tarkkojen käyttötarkoitusten mukaisesti määriteltyjen spesifikaatioiden mukaan", ja tekstiilien värjäämiseen tarkoitettujen ei-biologisten väriaineiden välillä, jotka "vaativat vähemmän tiukkoja ja vaativia valmistusstandardeja". Molemmat tuotetyypit kulkivat samalla nimellä, eikä niiden välinen ero koskaan ollut vain aste-ero. Puuvillalle laadittu spesifikaatio ja diagnostiselle reagenssille laadittu spesifikaatio eivät ole keskenään vaihdettavissa, eikä tekstiilispesifikaation mukaisesti valmistettua materiaalia ollut tarkoitettu nieltäväksi.

Azure B havainnollistaa asiaa selvimmin. Se on metyleenisinisen monodemetyloitu muoto, sillä on mitattavaa omaa farmakologista aktiivisuutta, ja sitä esiintyi kliinisissä metyleenisinivalmisteissa hallitsemattomana ainesosana yli vuosisadan ennen kuin nämä kaksi erotettiin toisistaan. Eräs tutkimusryhmä havaitsi, että metyleenisinisen annon jälkeen ruumiinavauksessa otetuissa ihmiskudosnäytteissä oli 5 to 14 per cent muuttumatonta metyleenisinistä ja 86 to 95 per cent azure B:tä. Se, pitäisikö tietyn valmisteen sisältää azure B:tä ja millä enimmäisrajalla, on spesifikaatiokysymys, ja tutkimus azure B:stä epäpuhtautena ja metaboliittina jatkaa aiheesta tästä eteenpäin.

Myös käytännön seuraus määräytyy spesifikaation perusteella. USP-vaatimustenmukaisuus on reitti markkinoiden tarjoamaan korkeimpaan puhtauteen, koska kyseessä on kokonainen julkaistu testausstandardi eikä yksittäinen mittaus. Se kattaa tunnistamisen, pitoisuusmäärityksen, orgaaniset epäpuhtaudet mukaan lukien atsuurivärit, liuotinjäämät, alkuaine-epäpuhtaudet, hehkutusjäännöksen, mikrobiologiset rajat ja bakteeriendotoksiinit. Sertifikaatti, jossa ilmoitetaan raskasmetallitulos ja kutsutaan sitä USP-vaatimustenmukaisuudeksi, raportoi vain yhden rivin tästä luettelosta.

Blupreme hankkii metyleenisinisensä lääketeollisuuden valmistajalta ja julkaisee täydellisen analyysitodistuksen sekä testaa koko USP-spesifikaation pelkkien raskasmetallien sijasta. Opas analyysitodistuksen lukemiseen ja se, mitä USP-merkintä osoittaa ja mitä se ei osoita, käsittelevät sitä, miten asiakirjaa verrataan esitettyyn väitteeseen.

Mitä historia oikeuttaa päättelemään ja mitä ei

Historiallinen jatkumo on todellinen, ja se on pidempi kuin useimmat tuotesivut antavat ymmärtää. Metyleenisinistä käytettiin malarian hoidossa vuonna 1891, sitä kuvattiin rauhoittavana aineena kiihtyneessä psykoosissa vuonna 1899, ja sen sivuketjun kehityslinja kulkee kinakriinin, klorokiinin, prometatsiinin ja klooripromatsiinin kautta. Ehrlichin vuonna 1890 Arthur Leppmannin kanssa julkaisemassa artikkelissa kuvattiin neuralgisen ja reumaattisen kivun lievittymistä, minkä jälkeen kirjoittajat harkitsivat väriaineen testaamista mielisairauksissa mutta päättivät olla tekemättä sitä.

Mikään tästä ei osoita nykyaikaista käyttötarkoitusta. Vuoden 1891 malariatulos perustui kahteen potilaaseen ja lämpötilakaavioon. Molekyylin pitkä käyttöhistoria on syy tutkia sitä, ei tutkimustulos. Yhdisteen historia lääkkeenä ja nykyaikaiset malariatutkimukset vastaavat eri kysymyksiin kuin ne, joita Ehrlich esitti, ja päätetapahtumia on arvioitava niiden omilla ehdoilla.

Historiallisissa tiedoissa on yksi yksityiskohta, joka kuuluu nykyhetkeen eikä menneisyyteen. Kun tutkijat toteuttivat metyleenisinisen malariatutkimuksia Burkina Fasossa 2000-luvulla, he joutuivat kilpailemaan lääkeluokan materiaalista ja raportoivat raaka-aineen hinnan nousseen noin satakertaiseksi sen saatua GMP-validoinnin. Väriaineen saattoi korvata toisella. Lääkettä ei. Lillien vuonna 1969 tekemä erottelu on sama, joka ratkaisee nykyäänkin, mitä pullo sisältää.