Κυανό του μεθυλενίου και μιτοχόνδρια: μεταφορά ηλεκτρονίων και ερευνητικά δεδομένα

Φανταστείτε δύο παρασκευάσματα το ένα δίπλα στο άλλο. Και τα δύο περιέχουν εγκεφαλικά μιτοχόνδρια δηλητηριασμένα με ροτενόνη, μια χημική ουσία που αποκλείει το Σύμπλοκο I της αναπνευστικής αλυσίδας. Στο ένα, ο ερευνητής προσθέτει με πιπέτα κυανό του μεθυλενίου σε μικρομοριακή συγκέντρωση. Η κατανάλωση οξυγόνου αποκαθίσταται εν μέρει. Το δυναμικό της μεμβράνης επανέρχεται εν μέρει. Η σύνθεση ATP ξαναρχίζει σε μικρό βαθμό. Στη διπλανή κυψελίδα, ένας αισθητήρας υπεροξειδίου αποκαλύπτει την άλλη μισή ιστορία: η παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου έχει πολλαπλασιαστεί, σε κάθε δόση που εξετάστηκε και με κάθε υπόστρωμα που δοκιμάστηκε.

Και οι δύο μετρήσεις είναι σωστές. Το κυανό του μεθυλενίου είναι ένας μεταφορέας ηλεκτρονίων που μπορεί να διατηρεί τη ροή γύρω από ένα κατεστραμμένο τμήμα της αναπνευστικής αλυσίδας, αλλά η ίδια αυτή μεταφορά έχει τίμημα σε υπεροξείδιο. Αν κρατήσετε ταυτόχρονα υπόψη και τα δύο αυτά δεδομένα, η βιβλιογραφία για το κυανό του μεθυλενίου και τη μιτοχονδριακή λειτουργία γίνεται κατανοητή. Αν κρατήσετε μόνο το ένα, μοιάζει με θαύμα ή με απειλή, ανάλογα με το ποια δημοσίευση ανοίξατε πρώτη.

Ο μηχανισμός μεταφοράς, με απλά λόγια

Η αναπνευστική αλυσίδα είναι μια γραμμή διαδοχικών μεταβιβάσεων. Τα ηλεκτρόνια εισέρχονται στο Σύμπλοκο I (από το NADH) ή στο Σύμπλοκο II και σε συναφή φλαβινικά ένζυμα (από το ηλεκτρικό οξύ και παρόμοιους δότες), περνούν μέσω του Συμπλόκου III στον κινητό φορέα κυτόχρωμα c και κατόπιν μέσω του Συμπλόκου IV στο οξυγόνο. Κάθε μεταβίβαση αντλεί πρωτόνια διαμέσου της εσωτερικής μεμβράνης και η προκύπτουσα βαθμίδωση τροφοδοτεί τη σύνθεση ATP. Αν αποκλειστεί οποιοσδήποτε σταθμός, το τμήμα της γραμμής πριν από αυτόν αδρανοποιείται.

Το κυανό του μεθυλενίου παρεμβάλλεται ως παράλληλος μεταφορέας. Η οξειδωμένη μορφή του παραλαμβάνει ηλεκτρόνια από φορείς που βρίσκονται νωρίτερα στην αλυσίδα και μετατρέπεται στην άχρωμη ανηγμένη μορφή, το λευκοκυανό του μεθυλενίου, η οποία στη συνέχεια παραδίδει αυτά τα ηλεκτρόνια παρακάτω στην αλυσίδα και γίνεται ξανά κυανή. Οι δύο μορφές περιγράφονται στην παρουσίαση του οξειδοαναγωγικού ζεύγους, ενώ η ευρύτερη συμπεριφορά μεταβίβασης αναλύεται στην εξήγηση του γενικού μηχανισμού. Το ανοιχτό ερώτημα είναι σε ποιο σημείο ο μεταφορέας επανεισέρχεται στην αλυσίδα: στον θύλακο δέσμευσης της κινόλης του Συμπλόκου III, γνωστό ως θέση Qo, ή απευθείας στο κυτόχρωμα c. Το ποια έξοδος κυριαρχεί εξαρτάται από τις συνθήκες, όπως εξηγεί λεπτομερώς η ανάλυση της παράκαμψης του Συμπλόκου III.

Τι μέτρησαν πραγματικά τρεις μελέτες σε τρωκτικά

Και οι τρεις μελέτες χρησιμοποίησαν απομονωμένα εγκεφαλικά μιτοχόνδρια, δηλαδή οργανίδια που αφαιρέθηκαν από το κύτταρο και διατηρήθηκαν σε εναιώρημα μέσα σε καθορισμένο ρυθμιστικό διάλυμα. Δεν υπήρχαν ακέραια κύτταρα, ζώα στα οποία χορηγήθηκε η ουσία ή άνθρωποι ως συμμετέχοντες. Οι συγκεντρώσεις αφορούν το διάλυμα γύρω από τα οργανίδια, όχι μια από του στόματος δόση για άνθρωπο. Αν κρατήσετε σταθερό αυτό το πλαίσιο, οι αριθμοί μιλούν καθαρά.

Η πρώτη μελέτη, σε απομονωμένα εγκεφαλικά μιτοχόνδρια ινδικών χοιριδίων σε συγκεντρώσεις από 100 νανομοριακά έως 2 μικρομοριακά, χαρτογράφησε όφελος και κόστος στο ίδιο παρασκεύασμα. Σε υγιή μιτοχόνδρια η χρωστική αύξησε την κατανάλωση οξυγόνου σε κατάσταση ηρεμίας, αλλά δεν επηρέασε την αναπνοή που διεγείρεται από το ADP, οπότε η συζευγμένη παραγωγή ATP δεν βελτιώθηκε. Με αποκλεισμένο το Σύμπλοκο I, η συγκέντρωση των 2 μικρομοριακών αποκατέστησε τη σύνθεση ATP από 46 σε 93 νανομόλ ανά λεπτό ανά χιλιοστόγραμμο, έναντι φυσιολογικού ρυθμού περίπου 1109. Με αποκλεισμένο το Σύμπλοκο III, η ίδια δόση αποκατέστησε την παραγωγή ATP από περίπου 46 σε 63, έναντι φυσιολογικού ρυθμού περίπου 910. Το δυναμικό και η πρόσληψη ασβεστίου αποκαταστάθηκαν εν μέρει. Ο αποκλεισμός του Συμπλόκου IV με κυανιούχα δεν μπορούσε να παρακαμφθεί, κάτι που τοποθετεί τη χρήσιμη έξοδο των ηλεκτρονίων πριν από ένα λειτουργικό Σύμπλοκο IV. Κάθε αποκατάσταση ήταν στατιστικά πραγματική αλλά μικρή: μονοψήφια ποσοστά της φυσιολογικής παραγωγής ATP.

Η δεύτερη μελέτη, σε μιτοχόνδρια του εγκεφαλικού φλοιού ποντικών σε συγκέντρωση περίπου 1 μικρομοριακού, επιβεβαίωσε την παράκαμψη του Συμπλόκου I και έθεσε ένα όριο στο Σύμπλοκο III. Η ροτενόνη μείωσε την αναπνοή από περίπου 121 σε λιγότερα από 2 νανομόλ οξυγόνου ανά λεπτό ανά χιλιοστόγραμμο και η χρωστική την αύξησε σε περίπου 21, δηλαδή περίπου στο ένα έκτο της φυσιολογικής, ενώ το δυναμικό της μεμβράνης αποκαταστάθηκε σχεδόν πλήρως. Όμως, μετά τον αποκλεισμό του Συμπλόκου III, ούτε η αναπνοή ούτε το δυναμικό αποκαταστάθηκαν σε συγκεντρώσεις από 1 έως 5 μικρομοριακά, και ο αποκλεισμός κατέστειλε το σήμα υπεροξειδίου που προκαλούσε η χρωστική. Οι συγγραφείς πρότειναν ότι η ανηγμένη χρωστική παραδίδει τα ηλεκτρόνιά της στη θέση Qo του Συμπλόκου III: όταν αυτή η θέση είναι κατειλημμένη, ο μεταφορέας δεν έχει πού να τα παραδώσει.

Η τρίτη μελέτη, σε εγκεφαλικά μιτοχόνδρια ποντικών, αρουραίων και ινδικών χοιριδίων κυρίως σε συγκέντρωση 2 μικρομοριακών, εξέτασε άμεσα τη διαφωνία και διαπίστωσε ότι ο αποκλεισμός του Συμπλόκου III μπορεί να παρακαμφθεί. Όταν ο αναστολέας της θέσης Qo, η μυξοθειαζόλη, μείωσε τη βασική αναπνοή κατά 88 τοις εκατό, η χρωστική αποκατέστησε την κατανάλωση οξυγόνου σε περίπου 62 τοις εκατό του ρυθμού χωρίς αποκλεισμό. Σε μια άμεση δοκιμή, συγκέντρωση μισού μικρομοριακού προκάλεσε αναγωγή του εξωγενούς κυτοχρώματος c ακόμη και με αποκλεισμένο το Σύμπλοκο III, υποστηρίζοντας μια διαδρομή από το NADH μέσω της χρωστικής προς το κυτόχρωμα c και στη συνέχεια προς το Σύμπλοκο IV. Όμως η αποκατεστημένη αναπνοή συμπεριφερόταν μη φυσιολογικά: η προσθήκη ADP μείωνε την κατανάλωση οξυγόνου αντί να την αυξάνει, ενώ ο αποκλεισμός της σύνθεσης ATP διέγειρε την αναπνοή. Το δυναμικό επανήλθε μόνο εν μέρει. Η υψηλή κατανάλωση οξυγόνου με ανεστραμμένη σύζευξη δεν αποτελεί φυσιολογική παραγωγή ενέργειας.

Γιατί διαφωνούν τα εργαστήρια και τι ξεκαθαρίζει το ζήτημα

Η εξήγηση που βασίζεται στο είδος του ζώου απορρίπτεται πρώτη. Η τρίτη ομάδα επανέλαβε την εργασία σε τρία είδη τρωκτικών και παρατήρησε την ίδια ποιοτική παράκαμψη σε όλα, συμπεριλαμβανομένου του στελέχους ποντικών στο οποίο είχε αναφερθεί ότι η παράκαμψη απουσίαζε. Αντί γι' αυτό, διαφέρουν η συγκέντρωση (1 έναντι 2 μικρομοριακών), οι δόσεις των αναστολέων, τα ρυθμιστικά διαλύματα, οι μέθοδοι απομόνωσης και, κυρίως, η ενεργειακή κατάσταση που συγκρίνεται: η παράκαμψη είναι σαφέστερη πριν από την προσθήκη ADP, ακριβώς εκεί όπου εμφανίζεται η παράδοξη απόκριση στο ADP. Επομένως, ένα διάγραμμα που αποδίδει πιστά τα δεδομένα δείχνει δύο εξόδους που εξαρτώνται από τις συνθήκες, μία στη θέση Qo και μία στο κυτόχρωμα c. Ο μεταφορέας παραδίδει εκεί όπου το επιτρέπει η τοπική χημεία.

Το τίμημα σε υπεροξείδιο

Τα δεδομένα για το κόστος είναι εξίσου συνεπή με εκείνα για την αποκατάσταση. Στη μελέτη με ινδικά χοιρίδια, η χρωστική αύξησε την απελευθέρωση υπεροξειδίου σε κάθε συνθήκη που εξετάστηκε —σε ηρεμία, κατά τη σύνθεση ATP και υπό χημική αναστολή— και με τα τρία υποστρώματα. Κατά τη σύνθεση ATP, η παραγωγή αυξήθηκε από περίπου 148 σε πάνω από 1500 πικομόλ ανά λεπτό ανά χιλιοστόγραμμο σε συγκέντρωση 1 μικρομοριακού, ενώ ακόμη και τα 100 νανομοριακά υπερτετραπλασίασαν το σήμα. Η χρωστική επιβράδυνε επίσης την απομάκρυνση του υπεροξειδίου περίπου κατά έναν παράγοντα 2.6, οπότε το σήμα αντανακλά ταχύτερο σχηματισμό μαζί με βραδύτερη απομάκρυνση. Η προτεινόμενη χημική εξήγηση είναι η άμεση αναγωγή του οξυγόνου από την ανηγμένη χρωστική χωρίς ανιχνεύσιμο υπεροξείδιο ανιόν, αν και αυτό παραμένει ερμηνεία και όχι αποδεδειγμένο βήμα.

Η μελέτη σε ποντικούς περιπλέκει την εικόνα με χρήσιμο τρόπο. Το υπεροξείδιο αυξήθηκε απότομα με τη δόση, από μια αρχική τιμή κοντά στα 76 σε σχεδόν 2000 πικομόλ ανά λεπτό ανά χιλιοστόγραμμο σε συγκέντρωση 2 μικρομοριακών, αλλά ο αποκλεισμός του Συμπλόκου III κατέστειλε τη συνιστώσα που προκαλούσε η χρωστική. Αν το υπεροξείδιο προερχόταν μόνο από την αντίδραση της ανηγμένης χρωστικής με το οξυγόνο, ο αποκλεισμός της αλυσίδας δεν θα έπρεπε να έχει τόσο μεγάλη σημασία. Έχει όμως, άρα η αλυσίδα συμμετέχει. Η ανασκόπηση της αντιοξειδωτικής και προοξειδωτικής δράσης τοποθετεί αυτή τη δυαδικότητα σε ευρύτερο πλαίσιο, ενώ η ανάλυση οξυγόνου έναντι ATP εξηγεί γιατί οι αριθμοί για το οξυγόνο από μόνοι τους δεν αρκούν ποτέ για να τεκμηριώσουν έναν ισχυρισμό σχετικά με την ενέργεια.

Η αποκατάσταση δεν είναι επιδιόρθωση

Η φράση που πρέπει να εγκαταλειφθεί είναι «επιδιορθώνει το κυανό του μεθυλενίου τα μιτοχόνδρια;». Επιδιόρθωση θα σήμαινε διαρκή διόρθωση: αναδόμηση των συμπλόκων, σύζευξη που διατηρείται αφού απομακρυνθεί η ουσία, αποκατάσταση σε ακέραια κύτταρα και κατόπιν βελτιωμένη λειτουργία σε έναν ζωντανό οργανισμό. Καμία από τις τρεις δημοσιεύσεις δεν δείχνει κάτι τέτοιο. Δείχνουν οξεία αναδρομολόγηση σε πρόσφατα απομονωμένα οργανίδια υπό τεχνητό χημικό αποκλεισμό, με παραγωγή ATP σε μικρά κλάσματα της φυσιολογικής και μερικές φορές με ξεκάθαρα παράξενη σύζευξη. Η ροτενόνη και η αντιμυκίνη είναι εργαστηριακά εργαλεία, όχι μοντέλα γήρανσης ή ανθρώπινης μιτοχονδριακής νόσου, και τίποτε εδώ δεν μεταφράζεται σε περισσότερη ενέργεια για έναν υγιή άνθρωπο. Αυτό είναι ξεχωριστό ερώτημα τεκμηρίωσης, με τη δική του βιβλιογραφία σε ανθρώπους.

Τρία όρια κρατούν κάθε συμπέρασμα για το biohacking εντός των δεδομένων. Πρώτον, η συγκέντρωση στο διάλυμα δεν είναι δόση: τα 0.1 έως 2 μικρομοριακά γύρω από απομονωμένα οργανίδια δεν λένε τίποτα για το ποια ποσότητα από το στόμα παράγει αυτή την ελεύθερη συγκέντρωση σε ένα μιτοχόνδριο ανθρώπινου εγκεφάλου, ιδίως επειδή η χρωστική συσσωρεύεται ή απελευθερώνεται ανάλογα με το ίδιο το δυναμικό της μεμβράνης. Δεύτερον, το οξυγόνο δεν είναι ενέργεια: η χρωστική μπορεί να αυξήσει την κατανάλωση οξυγόνου τόσο μέσω κυκλικών αντιδράσεων και διαρροής όσο και μέσω παραγωγικής φωσφορυλίωσης, οπότε η μέτρηση της αναπνοής χωρίς μετρήσεις ATP και δυναμικού δεν δικαιολογεί έναν ισχυρισμό για την ενέργεια. Τρίτον, το όφελος και η επιβάρυνση ανήκουν στην ίδια πρόταση: κάθε αναφορά σε αποκατεστημένο δυναμικό ή ATP που παραλείπει την ταυτόχρονη αύξηση του υπεροξειδίου παρουσιάζει λανθασμένα το πείραμα. Σχετικές επισημάνσεις περιλαμβάνουν την οξειδοαναγωγική ισορροπία του NAD, τη μορφή της καμπύλης δόσης–απόκρισης και τον οδηγό δοκιμασιών.

Μια πρακτική υποσημείωση: η μεταφορά ηλεκτρονίων είναι ιδιότητα του συγκεκριμένου μορίου. Απομεθυλιωμένα συγγενικά μόρια, όπως το Azure B, είναι επίσης οξειδοαναγωγικά ενεργά, αλλά έχουν διαφορετική συμπεριφορά, οπότε ένα εν μέρει αποδομημένο διάλυμα αποτελεί διαφορετικό πείραμα από εκείνο με άθικτη χρωστική. Αυτός είναι ένας λόγος να επιμένετε στην πλήρη προδιαγραφή της φαρμακοποιίας και σε ένα δημοσιευμένο έγγραφο παρτίδας, αντί για έναν έλεγχο μόνο για μέταλλα. Η φωτοεπαγόμενη χημεία προσθέτει μια παράλληλη επιφύλαξη για χρήσεις υπό φωτισμό, η οποία καλύπτεται στους συνδυασμούς με κόκκινο φως.

Ο στενά οριοθετημένος ισχυρισμός αντέχει σε όλα αυτά και αξίζει να διατηρηθεί: το κυανό του μεθυλενίου μπορεί να λειτουργήσει, υπό συγκεκριμένες συνθήκες, ως μεταφορέας ηλεκτρονίων σε απομονωμένα μιτοχόνδρια που έχουν υποστεί βλάβη, διατηρώντας εν μέρει τη ροή με τίμημα το υπεροξείδιο. Οτιδήποτε πέρα από αυτό —ενέργεια, μακροζωία, επιδιόρθωση— αναμένει δεδομένα που αυτές οι μελέτες δεν σχεδιάστηκαν ποτέ να δώσουν.