Die Experimente, die Methylenblau mit der Zellatmung in Verbindung brachten

Defibriniertes menschliches Blut, das drei Stunden lang auf 37 °C erwärmt wird, verbraucht etwa zwei Prozent des enthaltenen Sauerstoffs. Gibt man vor der Inkubation eine kleine Menge Methylenblau hinzu, verbraucht dasselbe Blut etwa fünfundsechzig Prozent. An den Zellen hatte sich nichts verändert. Nur an der Lösung.

Diese Zahl stammt aus einer Veröffentlichung von George Harrop und E. S. Guzman Barron an der Johns Hopkins University aus dem Jahr 1928. Sie ist der Ursprung der häufig wiederholten Aussage, dass Methylenblau die Zellatmung verbessert. Die Aussage ist nicht falsch, aber ihr Geltungsbereich ist enger, als sie vermuten lässt.

Was die Zahl in der Tabelle tatsächlich misst

Der Endpunkt war die Sauerstoffaufnahme, bestimmt durch Gasanalyse. Harrop und Barron filtrierten frisch entnommenes Blut bei 10 °C durch Watte, um die weißen Blutkörperchen zu entfernen, sättigten die Probe mit Sauerstoff, teilten sie auf, gaben zu einem Teil Farbstoff hinzu und analysierten beide Teile nach der Inkubation. Die Leukozytenzahl überschritt selten etwa tausend pro Kubikmillimeter. Der Sauerstoffverbrauch wurde als Anteil des anfänglichen Sauerstoffgehalts der Probe angegeben, der verschwunden war.

Sie maßen auch Kohlendioxid, doch dabei bereitete die Methode Schwierigkeiten. Defibriniertes Blut setzte in der ersten Inkubationsstunde bis zu zwei Millimol Kohlendioxid pro 100 mL frei, aus Gründen, die nichts mit der untersuchten Reaktion zu tun hatten. Deshalb waren die respiratorischen Quotienten aus Vollblut unbrauchbar. Nur gewaschene Zellen in Locke-Lösung lieferten interpretierbare Werte. Diese lagen mit und ohne Farbstoff zwischen 0.73 und 0.80.

Dieses Detail ist keine Nebensächlichkeit. „Atmung“ bedeutet in diesen Veröffentlichungen Gasaustausch in einem geschlossenen Gefäß. Der Unterschied zwischen Sauerstoffverbrauch und nutzbarer Energieausbeute wird gesondert in was der Sauerstoffverbrauch über ATP aussagt und was nicht untersucht.

Der Farbstoff bewirkte am meisten, wo die Zellen am wenigsten atmeten

Reife Säugetiererythrozyten haben fast keinen messbaren Sauerstoffverbrauch. Kernhaltige Vogelerythrozyten dagegen schon. Harrop und Barron untersuchten beide, und dieser Gegensatz bildet die Grundlage ihrer Argumentation.

In den Säugetierproben bewirkte der Farbstoff einen zwanzig- bis fünfzigfachen Anstieg. In Gänseblut, dessen Zellen bereits atmeten, erhöhte er die Rate höchstens auf das Doppelte. Je höher die Ausgangsatmung, desto weniger konnte der Farbstoff zusätzlich bewirken.

Derselbe Zusammenhang zeigt sich innerhalb einer Art. Eine menschliche Probe von einem Patienten mit Polycythaemia vera, die unreife Zellen enthielt, verbrauchte ohne Farbstoff 11.3 Prozent ihres Sauerstoffs, gegenüber 2.8 Prozent bei gewaschenen Zellen eines gesunden Spenders. Mit Farbstoff stieg der Wert lediglich auf 63.4 Prozent. Das entsprach einer sechsfachen Beschleunigung, während normale Zellen eine fast dreißigfache Beschleunigung zeigten. Der Farbstoff ließ reife Zellen eher wie unreife Zellen reagieren. Genau so beschrieben die Autoren seine Wirkung.

Cyanid hätte den Vorgang stoppen müssen

Es war bekannt, dass Cyanid die zelluläre Oxidation stoppt. Harrop und Barron gaben es dennoch hinzu, zusammen mit dem Farbstoff.

Die Ergebnisse mit Rinderblut sind repräsentativ. Ohne Zusätze sank der Sauerstoffgehalt innerhalb von drei Stunden von 22.61 auf 22.03 Volumenprozent. Mit Methylenblau sank er auf 12.84. Mit Methylenblau und einer ein Fünftausendstel molaren Kaliumcyanidkonzentration sank er auf 12.74. Die Wirkung des Farbstoffs blieb im Wesentlichen unverändert.

Abbildung: eine kontinuierliche Mikrorespirometrieaufzeichnung menschlicher Erythrozyten. Der Pfeil markiert die Zugabe von Methylenblau. Davor verläuft die Kurve nahezu flach; danach steigt sie stetig an. Reproduziert aus Harrop und Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Ihre Schlussfolgerung lautete, dass der Farbstoff als Sauerstoffträger wirke und „eine Substanz bereitstellt, die aus den reifen kernlosen Erythrozyten von Säugetieren verschwunden ist“. Zwei Jahre später formulierten Michaelis und Salomon am Rockefeller Institute die Meinungsverschiedenheit in ihrer bis heute gültigen Form. Entweder war die Wirkung des Farbstoffs „eine zufällige Eigenschaft des Farbstoffs“, oder der Farbstoff war „ein Modell für eine unbekannte Substanz in den Organismen“. Diese Alternative ist bis heute nicht entschieden. Verändert hat sich, dass sich die Zellen inzwischen wesentlich genauer beschreiben lassen.

Ein Leberextrakt bewirkte dasselbe

Michaelis und Salomon zeigten, dass mit kaltem Wasser hergestellte Organextrakte dieselbe Stimulation hervorrufen. Rattenleber wirkte am stärksten, gefolgt von Niere, Milz und Hoden. Gehirn, Muskel und Blutserum hatten wenig oder keine Wirkung.

Anschließend prüften sie den Extrakt unter Einwirkung von Kohlenmonoxid. Die durch den Extrakt oder den Farbstoff ausgelöste Atmung blieb in einer Mischung aus 98 Prozent Kohlenmonoxid und 2 Prozent Sauerstoff unverändert. Dieselbe Gasmischung hemmte die Atmung von Hefe und kernhaltigen Geflügelerythrozyten um etwa 60 bis 80 Prozent, im Einklang mit Warburgs Beschreibung eines kohlenmonoxidempfindlichen Atmungsferments. Die nicht identifizierte Gewebesubstanz war demnach nicht Warburgs Enzym.

Mehrere mögliche Identitäten wurden im Verlauf ausgeschlossen. Reduziertes Glutathion und Cystein verursachten nur den Sauerstoffverbrauch, den ihre eigene Oxidation erforderte. Das Coenzym von Harden und Young wurde ausgeschlossen, weil Muskelgewebe am meisten davon enthält und zugleich fast die geringste Wirkung zeigte. Keilins Cytochrom, das einige Jahre zuvor benannt worden war, führte zum selben Widerspruch. Ihre eigene Vermutung, dass die aktive Substanz aus dem Zellkern stamme, bezeichneten sie als bloße Vermutung.

Die Wirkung war an Bedingungen geknüpft

Die Zellen mussten intakt sein. Hämolyse durch destilliertes Wasser oder wiederholtes Einfrieren beseitigte die Reaktion sowohl auf den Farbstoff als auch auf den Extrakt. Partielle Hämolyse verringerte sie entsprechend ihrem Ausmaß.

Auch Zucker war erforderlich. Glucose, Fructose und Saccharose ermöglichten die durch den Farbstoff ausgelöste Atmung; Mannitol tat dies nicht. Ohne Zucker fand überhaupt keine Atmung statt, und der Farbstoff schien dabei die Zellen zu schädigen. Deshalb stellte Glucose, die eine oder zwei Stunden später hinzugegeben wurde, die Atmung nicht wieder her. Die Autoren vermuteten, dass der Farbstoff einen strukturellen Bestandteil oxidierte, den die Zelle benötigte.

Beleuchtung verstärkte die Wirkung des Farbstoffs erheblich, obwohl sie auch im Dunkeln deutlich war. Andere reduzierbare Farbstoffe verhielten sich anders: Toluylenblau erreichte oder übertraf die Wirkung von Methylenblau, während Indigodisulfonat fast nichts bewirkte. Es ergab sich kein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem Redoxpotenzial eines Farbstoffs und dem Ausmaß seiner Wirkung. Die Autoren führten dies auf Membranpermeabilität und Toxizität zurück.

Die Wirkung folgte der Gärung, nicht der Atmung

Barrons Studie von 1930 ging von Zellsuspensionen zu Gewebeschnitten normaler Rattenorgane und transplantierter Tumoren über.

In Geweben ohne aerobe Glykolyse bewirkte Methylenblau nichts oder verringerte den Sauerstoffverbrauch leicht: in der Niere um etwa 14 Prozent, in der Bauchspeicheldrüse um etwa 14 Prozent, in der Leber um etwa 5 Prozent. In Geweben, die unter Sauerstoff Gärung betreiben, erhöhte es den Verbrauch: in der Milz um etwa 8 Prozent, im Gehirn um etwa 13 Prozent. Die Anstiege bei Tumoren reichten von etwa 27 Prozent bei einem menschlichen Brustkarzinom bis zu mehr als 80 Prozent bei einem Rous-Sarkom des Huhns, ungefähr proportional zur aeroben Glykolyse des jeweiligen Gewebes.

Abbildung: jeder Punkt steht für einen Gewebetyp. Die horizontale Achse zeigt die aerobe Glykolyse; die vertikale Achse zeigt die Veränderung des Sauerstoffverbrauchs nach Zugabe von Methylenblau. Daten aus Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tabelle 6, PMID 19869777.

Das Cyanidexperiment ergab anschließend das Spiegelbild. Als die Atmung in den zuvor nicht reagierenden Geweben durch Cyanid blockiert wurde und die Gärung hervortrat, erhöhte der Farbstoff den Sauerstoffverbrauch wieder: in der Niere um etwa 59 Prozent, in der Leber um etwa 19 Prozent, in der Milz um etwa 286 Prozent, im Hoden um etwa 200 Prozent.

Barron schlug vor, den Farbstoff als Test für die Gärungsleistung einer Zelle oder eines Gewebes einzusetzen, und schloss mit einer Spekulation: Die Kultivierung von Tumoren über Generationen in einem farbstoffhaltigen Medium könnte eines Tages den Stoffwechsel eines Tumors dauerhaft dem normalen Gewebes angleichen. Das war eine Forschungsfrage aus dem Jahr 1930. Es ist keine Aussage über eine Behandlung.

Was die Experimente nicht gemessen haben konnten

1928 und 1930 bedeutete „Atmung“ Sauerstoffverbrauch. Über Adenosintriphosphat wurde erstmals 1929 berichtet. Der Nachweis, dass isolierte Mitochondrien bei der Elektronenübertragung Phosphat verestern, erfolgte 1949. Keine der frühen Veröffentlichungen zu Methylenblau konnte die Energieproduktion gemessen haben, und keine behauptete dies.

Das zweite Problem sind die Zellen. Reife Säugetiererythrozyten enthalten keine Mitochondrien. Im Retikulozytenstadium entfernen sie Mitochondrien und Ribosomen durch selektive Autophagie. Deshalb gewinnt ein reifes rotes Blutkörperchen seine Energie durch Glykolyse und ist auf seinen Pentosephosphatweg hauptsächlich für NADPH angewiesen, nicht für ATP. In den Experimenten von 1928 war keine Elektronentransportkette vorhanden, die hätte repariert werden können. Was auch immer den Sauerstoff verbrauchte, es tat etwas anderes.

Was dieses andere Geschehen war, ist inzwischen recht gut beschrieben. Methylenblau nimmt Elektronen von zellulären Reduktionsäquivalenten auf und wird zu Leukomethylenblau. Dieses wird durch molekularen Sauerstoff wieder oxidiert, wodurch sich der Kreislauf schließt. In menschlichen roten Blutkörperchen übernehmen NADPH-abhängige Flavinreduktase und verwandte Disulfidreduktasen den Reduktionsschritt. Eine Studie von 1976 mit markierter Glucose stellte fest, dass der Farbstoff den Hexosemonophosphatweg stimuliert, dass die Wirkung bei niedriger Konzentration von Oxyhämoglobin abhing und dass eine höhere Konzentration von 0.1 mM Wasserstoffperoxid erzeugte. Trifft ein reduzierter Farbstoff auf Sauerstoff, entstehen Peroxide, keine Phosphatbindungen.

In Mitochondrien ist das Bild umstrittener, als populäre Zusammenfassungen erkennen lassen. Eine Forschungsrichtung geht davon aus, dass der Farbstoff Elektronen aus dem Bereich von Komplex I aufnimmt und an Cytochrom c weitergibt. Eine andere stellte fest, dass er in Mitochondrien aus Mäusegehirnen die Atmung nach einer Blockade durch Antimycin nicht wiederherstellen kann, und verortete den Elektronenakzeptor stattdessen an der Ubichinol-Bindungsstelle von Komplex III. Eine dritte fand, dass niedrige Konzentrationen den Sauerstoffverbrauch im Ruhezustand erhöhten, während die ADP-stimulierte Atmung unverändert blieb. Die unmittelbarste Aussage dazu lautet, dass der durch Methylenblau ausgelöste Sauerstoffverbrauch überhaupt nicht von der oxidativen Phosphorylierung abhängt: Er blieb bestehen, wenn die Atmungskette gehemmt wurde, und auch in Präparationen ohne Atmungskette.

Es gibt auch direkte Messungen des Unterschieds zwischen den beiden Größen. In isolierten Rattenlebermitochondrien senkten steigende Farbstoffkonzentrationen die respiratorischen Kontrollquotienten und verursachten eine Schwellung. Die Autoren beschrieben dies als Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung. In perfundierter Rattenleber erhöhte Methylenblau den Sauerstoffverbrauch, während das ATP-zu-ADP-Verhältnis sank.

Die klinische Literatur vermittelt dieselbe Aussage. Methämoglobinämie wird mit etwa einem bis zwei Milligramm Methylenblau pro Kilogramm intravenös über einen NADPH-abhängigen Reduktionsweg behandelt. Höhere Dosen verursachen die Erkrankung, die behandelt wird. Derselbe Übersichtsartikel stellt fest, dass die antidotische Wirkung in intakten Erythrozyten am größten ist und bei Hämolyse abnimmt. Damit taucht der Hämolysebefund von 1930 dreiundsiebzig Jahre später im klinischen Kontext wieder auf. Bei einer Verbindung, deren nützliche und schädliche Wirkungen auf entgegengesetzten Seiten einer Dosisschwelle liegen, sollte die Dosis nicht aus einer Messung des Sauerstoffverbrauchs abgeleitet werden.

Warum die Charge in die Diskussion gehört

Harrop und Barron bemerkten etwas, das eine erneute Lektüre verdient. Methylenblau selbst erzeugt im Spektroskop eine Bande zwischen den beiden charakteristischen Banden von Methämoglobin, „was bei flüchtiger Betrachtung leicht zu Verwechslungen führen kann“. Der Farbstoff kann die gesuchte Substanz imitieren.

Dasselbe Problem hat eine chemische Form. Ein verwandtes Phenothiazin, das als Nebenbestandteil vorhanden ist, besitzt ein eigenes Redoxverhalten, eine eigene Permeabilität und eine eigene Toxizität. Ein dokumentierter Fall zeigt konkret, was dies bedeutet: In einer Studie zur Iodierung von Methylenblau erzeugten Proben mit etwa 7 bis 8 Prozent Azure B hauptsächlich iodiertes Azure B. Somit bestimmte die Verunreinigung die Reaktion, nicht das Methylenblau.

Wer Methylenblau als Reagenz verwendet, im Labor, am Färbeplatz oder im Aquarium, arbeitet mit einem nicht spezifizierten Stoff, solange die Charge nicht charakterisiert wurde. Verwandte Substanzen, Identität, elementare Verunreinigungen, Restlösungsmittel und Glührückstand sind Teil des Experiments und keine bloße Begleitdokumentation. Blupreme bezieht sein Methylenblau von einem pharmazeutischen Hersteller und veröffentlicht ein vollständiges Analysenzertifikat. Dabei wird die gesamte USP-Spezifikation geprüft, nicht nur der Gehalt an Schwermetallen. Der Leitfaden zum Lesen eines Analysenzertifikats und was die Bezeichnung USP-Qualität belegt und was nicht erläutern, wie sich das Dokument mit der jeweiligen Aussage abgleichen lässt.

Die Zahl war richtig

Die Experimente von 1928 und 1930 waren sorgfältig durchgeführt, und ihre zentrale Beobachtung hat Bestand: Ein reduzierbarer Farbstoff kann eine Zelle, die kaum atmet, dazu bringen, Sauerstoff mit einem Vielfachen ihrer Rate im Ruhezustand zu verbrauchen, ohne den Schritt zu durchlaufen, den Cyanid blockiert.

Der Fehler entsteht später, wenn „Atmung“ in seiner heutigen Bedeutung gelesen wird. Eine Gasaustauschmessung zeigt, dass Elektronen den Sauerstoff erreicht haben. Sie zeigt nicht, dass irgendwelche davon zur ATP-Bildung genutzt wurden. In einer Zelle ohne Mitochondrien ist der Abstand zwischen diesen beiden Aussagen so groß wie nur möglich. Die umfassendere Übersicht darüber, was Methylenblau in Zellen bewirkt ordnet dieselbe Unterscheidung in einen größeren Zusammenhang ein. Die Geschichte der Verbindung vom Farbstoff zum Arzneimittel erklärt, wie ein Textilfarbstoff überhaupt in diese Experimente gelangte.