Geschichte von Methylenblau: vom Textilfarbstoff von 1876 zum Arzneimittel

Methylenblau erreichte einen Patienten, bevor es eine Apotheke erreichte.

Der Bericht von Paul Guttmann und Paul Ehrlich aus dem Jahr 1891 über die Anwendung des Farbstoffs bei Malaria enthält zwei Temperaturkurven. Die zweite reicht vom 13. Juli bis zum 5. August, wobei die Behandlung Tag für Tag am Rand vermerkt ist. Die Einträge vom 18. und 19. Juli lauten „1 × 0,05 Methylenblau“. An den folgenden Tagen sind fünf beziehungsweise sieben Dosen derselben Menge verzeichnet, und bis zum 22. Juli ist auch eine kleine Menge Chinin in der Aufzeichnung hinzugekommen. Die Fieberkurve, die in der ersten Hälfte des Diagramms zwischen 37 °C und 39.5 °C schwankt, flacht nach dem Auftreten des Farbstoffs ab und bleibt für die verbleibenden drei Wochen zwischen etwa 36 °C und 37.5 °C.

Der Patient war einer von zwei Männern, die in der Veröffentlichung als Hausdiener und Matrose beschrieben wurden. Die Substanz, die sie erhielten, war seit fünfzehn Jahren ein kommerzieller Textilfarbstoff, und die beiden Männer gehören zu den ersten dokumentierten Personen, die mit einem vollständig synthetischen Arzneistoff behandelt wurden, der gegen einen bestimmten Organismus gerichtet war.

Der Farbstoff kam zuerst

Der erste kommerziell erfolgreiche synthetische Farbstoff wurde 1856 von William Henry Perkin entwickelt. Perkin war achtzehn Jahre alt, arbeitete während der Osterferien in einem Heimlabor und versuchte, Chinin zu synthetisieren. Stattdessen erhielt er einen schwarzen Rückstand, löste ihn auf und entdeckte eine Farbe, die sich brillant auf Seide fixierte. Er ließ sie im August 1856 patentieren und betrieb Ende 1857 eine Fabrik, die eine Londoner Seidenfärberei belieferte.

1875 synthetisierte Adolf von Baeyer einen roten Farbstoff und nannte ihn Eosin, nach Eos, dem griechischen Wort für die Morgenröte. 1876 entwickelte Heinrich Caro, damals Leiter des Labors der Badischen Anilin- und Soda-Fabrik, zusammen mit Baeyer Methylenblau als anilinbasierten Farbstoff für Baumwolle. Seine chemische Struktur wurde erst etwa neun Jahre später geklärt.

Dieser Ursprung ist noch heute an der Benennung der Substanz erkennbar. „Methylenblau“ ist ein Handelsname aus dem Farbstoffkatalog und keine chemische Beschreibung. Die damit bezeichnete Verbindung ist Methylthioniniumchlorid, und die Unterschiede zwischen dem Namen, dem Salz und seinen Hydraten werden relevant, sobald jemand das Material wiegt oder eine Spezifikation liest.

Die Färbung bildete die Brücke

Der Weg von der Färberei ins Krankenhaus führte durch das Mikroskop und begann noch vor der Existenz von Methylenblau. Wilhelm Erb war der erste Mensch, der einen synthetischen Farbstoff auf Blut anwendete. Er verwendete 1865 Pikrinsäure und beobachtete in einigen roten Blutkörperchen ein retikuläres Muster.

Paul Ehrlichs Dissertation von 1878 verglich die histologische Färbung mit dem Färben von Textilien und argumentierte, dass beides chemische Reaktionen seien. Bei seiner Arbeit unter Robert Koch am Tuberkelbazillus teilte er Anilinfarbstoffe in saure und basische Klassen ein und stellte fest, dass jede Klasse unterschiedliche Teile einer Zelle färbte. 1880 mischte er beide miteinander: Eine gesättigte Methylenblaulösung wurde in saures Fuchsin gegossen, bis der Überstand klar wurde. Das Ergebnis, das er neutralen Farbkörper beziehungsweise Neutralfärbung nannte, erzeugte drei Farben statt einer, machte zuvor unsichtbare Granula in polymorphkernigen Zellen sichtbar und ermöglichte erstmals eine Differenzialzählung der Leukozyten. Da diese Granula beide Bestandteile der Mischung aufnahmen, prägte Ehrlich für die Zellen, die sie enthielten, den Begriff Neutrophil.

Zwei Jahre später verwendete Koch Methylenblau, um den Tuberkelbazillus nachzuweisen, und 1883 verbesserte Ehrlich die Methode. 1886 veröffentlichte er eine Beobachtung anderer Art: Er injizierte den Farbstoff lebenden Tieren, verglich, wie stark die einzelnen Organe ihn aufnahmen, und kam zu dem Schluss, dass er eine ausgeprägte Affinität zu Gehirn- und Nervengewebe besaß. Er führte diese Affinität auf den Oxidations-Reduktions-Zyklus des Farbstoffs zurück, den er im Vorjahr beobachtet hatte. Dieser Zyklus ist auch der Grund dafür, dass eine Methylenblaulösung ihre Farbe verliert, wenn ihr Sauerstoff verbraucht wird, und sie wiedererlangt, wenn erneut Luft hinzukommt. Die Experimente, in denen die Folgen dieses Zyklus erstmals gemessen wurden, gehören in ein späteres Jahrzehnt, und der Mechanismus selbst ist ein eigenes Thema, unabhängig von der Geschichte.

Der Parasit und der violette Zellkern

Alphonse Laveran entdeckte 1880 den Malariaparasiten, indem er frisches, ungefärbtes Blut untersuchte. Um ihn routinemäßig in einem getrockneten Ausstrich zu erkennen, war eine Färbung erforderlich, und die damaligen Färbungen erzeugten nur Rot und Blau.

1888 ersetzte der polnische Pathologe Czesław Cheçinski das saure Fuchsin durch Eosin und erzeugte eine Mischung aus Methylenblau und Eosin. Der seiner Methode zugrunde liegende Fall betraf einen Soldaten, der am 30. September 1887 an Malaria gestorben war. In den Blutausstrichen sah Cheçinski blaue, gänseblümchenartige Formen, die heute als Plasmodium malariae erkannt werden, sowie sichelförmige Formen, die heute als Gametozyten von Plasmodium falciparum bekannt sind. Das Ergebnis widerlegte gleichzeitig zwei konkurrierende Erklärungen der Krankheit: die Miasmentheorie und die Behauptung von Edwin Klebs und Corrado Tommasi-Crudeli, Malaria werde durch ein Bakterium verursacht.

Der Parasit war sichtbar. Sein Zellkern war es nicht, wodurch seine Natur ungeklärt blieb. Ernst Malachowski, ein Arzt in Breslau, löste dieses Problem zunächst zufällig und dann gezielt. 1889 bemerkte er in einem Präparat eine differenzielle Färbung des Plasmodienkerns, konnte sie jedoch nicht reproduzieren. Eine Ansäuerung des Methylenblaus half nicht. Durch Alkalisieren mit Borax trat der Effekt jedes Mal auf. Am 15. Juni 1890 demonstrierte er die Technik öffentlich und veröffentlichte sie noch im selben Jahr; im August 1891 folgte eine ausführlichere Methode.

Dmitri Romanowsky veröffentlichte im September 1891 seine eigene Version. Seine besten Ergebnisse erzielte er mit einer vernachlässigten, verschimmelten Flasche Methylenblaulösung, die mehr als zwei Monate alt war. Malachowskis Beschreibung war gezielt entwickelt und nach seinen Worten leicht reproduzierbar; Romanowskys Ansatz war eine Sackgasse, die einmal funktionierte. Dennoch erhielt Romanowsky das Eponym, und der Streit darüber, wer die violette Färbung erzeugte, die den Zellkern sichtbar machte, ist eine eigene Geschichte mit eigenen Dokumenten.

Abbildung:** das zweite Temperaturdiagramm aus dem Bericht von Guttmann und Ehrlich von 1891. Der obere Abschnitt umfasst den 13. bis 24. Juli und der untere den 25. Juli bis 5. August; die Randnotizen nennen die verabreichten Dosen, und die Temperatur bleibt in den letzten drei Wochen der Aufzeichnung nahe dem Normalbereich. Reproduziert aus dem Bericht in der für Krafts, Hempelmann und Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), gescannten Fassung, PMID 22411634.

Die Reifung erwies sich als Demethylierung

Niemand, der in den 1890er-Jahren daran beteiligt war, wusste, was die „Reifung“ mit Methylenblau bewirkte. Die Antwort kam aus der Industriechemie. Heinrich August Bernthsen hatte 1883 die Stammverbindung Phenothiazin synthetisiert, 1885 festgestellt, dass Methylenblau zu dieser Familie gehörte, und im selben Zeitraum gezeigt, dass alkalische Bedingungen Methylgruppen vom Farbstoff abspalten und dadurch die heute als Azure bezeichneten Verbindungen entstehen.

Bernard Nocht extrahierte 1898 und 1899 die aktive Fraktion und konnte sie lediglich Rot aus Methylenblau nennen. Michaelis identifizierte sie 1901 als Azur I. Jenner führte 1899 absolutes Methanol als Lösungsmittel für den Farbstoffniederschlag ein, wodurch das Hitzefixieren von Blutausstrichen überflüssig wurde; Leishman und Reuter kombinierten beide Fortschritte; Wright veröffentlichte 1902 eine vereinfachte Methode. Giemsas Beitrag, ebenfalls aus dem Jahr 1902, bestand darin, nicht länger auf eine zufällig gereifte Lösung zu vertrauen, sondern stattdessen abgemessene Mengen bekannter Farbstoffe zu verwenden. Anschließend lehnte er es ab zu veröffentlichen, wie er reines Methylenazur herstellte, und verkaufte die Methode an das Labor von Dr. Grübler, das das Produkt als Azur I vermarktete und behauptete, nur seine Variante sei eine authentische Giemsa-Färbung.

Zwei Weltkriege vollendeten diese Entwicklung unbeabsichtigt. Als deutsche Farbstoffe nicht mehr erhältlich waren, untersuchten Lillie, Roe und Wilcox amerikanische Ersatzstoffe und stellten fest, dass die beste Färbung mit drei getrennten Komponenten erzielt wurde: reinem Methylenblau, seinem Abbauprodukt Azure B und Eosin. Diese drei sind bis heute die Hauptbestandteile der Färbung, die zur Diagnose von Malaria verwendet wird und deren Name inzwischen Malachowski, Wright und Giemsa miteinander verbindet.

Abbildung:** Ringformen von Plasmodium falciparum in menschlichen roten Blutkörperchen, gefärbt mit einer Methode vom Romanowsky-Typ. Die violette Struktur innerhalb des Rings ist das Chromatin, das durch Malachowskis mit Borax behandeltes Methylenblau erstmals sichtbar wurde. Bild von Ernst Hempelmann, gemeinfrei veröffentlicht.

Ein Name, mehrere Materialien

Die Jahre, in denen diese Komponenten voneinander getrennt wurden, hinterließen ein Problem, das die chemische Entwicklung überdauerte. Ralph Lillie zog 1969 die Grenze zwischen biologischen Farbstoffen, die „nach strengen Spezifikationen hergestellt werden, die ihren empfindlichen und anspruchsvollen Anwendungen entsprechen“, und nicht biologischen Farbstoffen für die Textilfärbung, die „weniger strenge und anspruchsvolle Herstellungsstandards erfordern“. Beide Produktarten trugen denselben Namen, und der Unterschied zwischen ihnen war nie lediglich graduell. Eine Spezifikation für Baumwolle und eine Spezifikation für ein diagnostisches Reagenz sind nicht austauschbar, und ein nach der Textilspezifikation hergestelltes Material war nicht zum Einnehmen bestimmt.

Azure B ist das deutlichste Beispiel. Es ist die monodemethylierte Form von Methylenblau, besitzt eine eigene messbare pharmakologische Aktivität und war mehr als ein Jahrhundert lang als unkontrollierter Bestandteil klinischer Methylenblaupräparate vorhanden, bevor die beiden Stoffe voneinander getrennt wurden. Eine Forschungsgruppe stellte fest, dass menschliches Gewebe, das nach der Verabreichung von Methylenblau bei einer Autopsie entnommen wurde, 5 bis 14 Prozent unverändertes Methylenblau und 86 bis 95 Prozent Azure B enthielt. Ob ein bestimmtes Präparat Azure B enthalten sollte und welcher Grenzwert gelten sollte, ist eine Frage der Spezifikation; die Forschung zu Azure B als Verunreinigung und Metabolit setzt an diesem Punkt an.

In einer Spezifikation liegt auch die praktische Konsequenz. Die Einhaltung der USP ist der Weg zur höchsten am Markt angebotenen Reinheit, weil es sich um einen vollständigen veröffentlichten Prüfstandard und nicht um eine einzelne Messung handelt. Er umfasst Identität, Gehaltsbestimmung, organische Verunreinigungen einschließlich der Azure-Farbstoffe, Restlösungsmittel, elementare Verunreinigungen, Glührückstand, mikrobielle Grenzwerte und bakterielle Endotoxine. Ein Zertifikat, das ein Schwermetallergebnis angibt und dies als USP-Konformität bezeichnet, hat lediglich eine Position dieser Liste ausgewiesen.

Blupreme bezieht sein Methylenblau von einem pharmazeutischen Hersteller und veröffentlicht das vollständige Analysezertifikat, wobei die gesamte USP-Spezifikation und nicht nur Schwermetalle geprüft wird. Der Leitfaden zum Lesen eines Analysezertifikats und die Erklärung dazu, was die USP-Bezeichnung belegt und was nicht, zeigen, wie sich das Dokument mit der jeweiligen Aussage abgleichen lässt.

Was die Geschichte belegt und was nicht

Die historische Entwicklung ist real und reicht weiter zurück, als die meisten Produktseiten vermuten lassen. Methylenblau wurde 1891 zur Behandlung von Malaria eingesetzt, 1899 als Sedativum bei agitierten Psychosen beschrieben, und seine chemische Seitenlinie führt über Quinacrin, Chloroquin, Promethazin und Chlorpromazin. Ehrlichs Veröffentlichung von 1890 zusammen mit Arthur Leppmann beschrieb eine Linderung neuralgischer und rheumatischer Schmerzen und erwog anschließend eine Erprobung des Farbstoffs bei psychischen Erkrankungen, entschied sich jedoch dagegen.

Nichts davon belegt eine heutige Anwendung. Das Malariaergebnis von 1891 beruhte auf zwei Patienten und einem Temperaturdiagramm. Die lange Vertrautheit mit einem Molekül ist ein Grund, es zu untersuchen, kein Ergebnis. Die Geschichte der Verbindung als Arzneistoff und die modernen Malariastudien beantworten andere Fragen als diejenigen, die Ehrlich stellte, und die Endpunkte müssen nach ihren eigenen Kriterien beurteilt werden.

Ein Detail in den historischen Aufzeichnungen gehört eher zur Gegenwart als zur Vergangenheit. Als Forscher in den 2000er-Jahren in Burkina Faso Malariastudien mit Methylenblau durchführten, konkurrierten sie um Material in pharmazeutischer Qualität und berichteten, dass der Preis des Rohmaterials nach einer GMP-Validierung ungefähr um den Faktor hundert gestiegen war. Ein Farbstoff konnte ersetzt werden. Ein Arzneistoff nicht. Die Unterscheidung, die Lillie 1969 zog, ist dieselbe, die heute darüber entscheidet, was eine Flasche enthält.