Jak funguje methylenová modř? Redoxní chemie a mechanismy

Baňka se zátkou na laboratorním stole je nejstručnějším poctivým úvodem do toho, jak methylenová modř funguje. Voda, glukóza, špetka hydroxidu sodného a dostatek barviva, aby kapalina získala sytou, nezaměnitelnou modrou barvu. Po několika minutách modř postupně zmizí, až baňka vypadá jako baňka s vodou. Protřepejte ji a barva se okamžitě vrátí. Potom znovu vybledne a tento cyklus bude pokračovat tak dlouho, dokud bude přítomna glukóza ochotná odevzdávat elektrony a kyslík ochotný je přijímat.

Na samotném barvivu se nezměnilo nic kromě počtu elektronů, které nese. V oxidované formě je modré. V redukované nikoli. Téměř vše ostatní, co se o této molekule uvádí v terapeutické a výzkumné literatuře, vychází z tohoto jediného vratného kroku, protože molekula schopná přijmout elektrony od jednoho partnera a předat je jinému funguje jako přenašeč a přenašeč sám o sobě nic nedělá. Jeho účinek zcela závisí na tom, co se nachází na obou jeho koncích.

Dvě formy a proč na tomto páru záleží

Oxidovaná forma je plochý, kladně nabitý kruhový systém. Právě tento plochý nabitý tvar vysvětluje, proč se vrství podél nukleových kyselin, proč se váže na sialylované struktury buněčných membrán a proč silně absorbuje viditelné světlo mezi zhruba 600 and 700 nanometres, tedy v části spektra, kterou lidské oko vnímá jako modrou.

Redukovaná forma má jiné vlastnosti. Nemá náboj, rozpouští se spíše v tucích než ve vodě a je bezbarvá. Její ionizace je při pH uvnitř těla velmi nízká, řádově několik per cent. Redukovaná molekula proto snadno prochází buněčnou membránou difuzí a uvnitř buňky, kde je prostředí více oxidační, může být znovu oxidována a fakticky zachycena. Oxidovaný kruhový systém je plochý; redukovaný se může stáčet. Tyto strukturní důsledky i samotná změna barvy jsou samostatnou součástí příběhu obou forem a podrobněji je popisuje srovnání methylenové modři a leukomethylenové modři.

Přijímání elektronů

Oxidované barvivo přijímá elektrony od široké škály donorů. Jedním z nich je glukóza v demonstrační baňce. Uvnitř buňky mezi další patří redukované pyridinové nukleotidy a složky mitochondriálního elektronového transportního řetězce. Když se methylenová modř redukuje v tkáni obsahující kyslík, vzniklý cyklus spotřebovává jak redukční činidlo, tak kyslík a vytváří reaktivní formy kyslíku, především peroxid vodíku. Barvivo z cyklu vystupuje beze změny a je připraveno jej opakovat.

Tento poslední bod vysvětluje zdánlivý rozpor, který by jinak působil nedbale. Methylenová modř je v literatuře popisována jako prooxidant i antioxidant a oba popisy lze obhájit. Může potlačovat tvorbu superoxidu tím, že funguje jako umělý akceptor elektronů a odvádí tok elektronů od enzymových míst, kde by jinak kyslík byl přeměňován na superoxidové radikály. V kulturách jaterních buněk bylo prokázáno, že indukuje antioxidační obranné enzymy fáze 2, včetně thioredoxinreduktázy 1 a NADPH chinonoxidoreduktázy. Kterou z těchto dvou tváří uvidíte, závisí na tom, na kterém konci přenosu je v daném okamžiku nedostatek elektronů. Otázka typu „je methylenová modř antioxidant“ není správně formulovaná, dokud není uvedeno, v jakém systému, při jaké koncentraci a za přítomnosti jakých dalších látek.

Předávání elektronů dál

Jakmile barvivo nese přebytečný elektron, mohou následovat tři zcela odlišné děje, které se často popisují pod jedním nadpisem. Neměly by se směšovat.

Může předat elektron kovovému centru. Nejjasnějším příkladem je hemoglobin, který byl oxidován ze železnatého do železitého stavu. V tomto stavu nemůže přenášet kyslík. V červených krvinkách enzym redukuje barvivo a redukované barvivo potom neenzymaticky předává elektrony oxidovanému hemovému železu, čímž obnovuje funkční hemoglobin a samo se vrací do oxidované formy. Barvivo se při tomto procesu nespotřebovává; cyklicky se obnovuje. Klinické použití založené na této reakci patří do nemocničního prostředí a vysvětlení použití methylenové modři při methemoglobinemii popisuje, jak se používá a proč vyžaduje tak pečlivý dohled.

Poznámka k interpretaci zdrojů: dvě přehledové práce, z nichž tento článek vychází, neuvádějí pro enzymový krok stejný redukční kofaktor; jedna uvádí NADH a druhá NADPH. Tento rozpor je skutečný a v dostupných zdrojích není vyřešen, proto je bezpečnější popisovat úlohu jednotlivých částí než uvádět jediný název kofaktoru.

Za přítomnosti světla může předat energii nebo elektron kyslíku. Tato cesta existuje pouze při osvětlení. Excitované barvivo přechází do tripletového stavu a odtud jsou možné dva mechanismy. Při prvním excitované barvivo přímo interaguje se sousední molekulou, odebírá vodík nebo přenáší elektron, čímž vznikají radikály; reakce s vodou tímto způsobem vytváří hydroxylové radikály. Při druhém se excitační energie předá samotnému kyslíku a vzniká singletový kyslík, vysoce elektrofilní forma, která zaniká během mikrosekund a je obecně považována za hlavní cestu, kterou osvětlená methylenová modř poškozuje mikrobiální buňky. Mezi zdokumentované výsledky patří reakce s lipidy a peptidy buněčného obalu a s guaninovými bázemi v DNA.

Praktickým důsledkem této cesty je, že osvětlení mění naměřené hodnoty o celé řády. V datech shromážděných Wainwrightem a Crossleym má methylenová modř proti Pseudomonas aeruginosa minimální baktericidní koncentraci kolem 500 micromolar ve tmě a kolem 25 micromolar při světelné dávce 12 joules per square centimetre. Proti jednomu kmeni Staphylococcus aureus jsou hodnoty ve tmě i při osvětlení shodně 5 micromolar. Jinými slovy, zda lze molekulu vůbec považovat za antimikrobiální, není vlastností samotné molekuly; je to vlastnost kombinace molekuly a světla.

Může působit přímo v enzymovém místě bez elektronového přenosu. Methylenová modř oxiduje železnaté železo vázané na syntázu oxidu dusnatého, čímž enzym deaktivuje. Blokuje rozpustnou guanylátcyklázu a 1 to 10 micromolar je běžná laboratorní koncentrace používaná k tomuto účelu. Inhibuje monoaminooxidázu typu A s IC50 mezi 27 and 180 nanomolar, což je mechanismus stojící za dobře zdokumentovanou interakcí s inhibitory zpětného vychytávání serotoninu a důvod, proč lékové interakce methylenové modři tvoří samostatnou kategorii.

Tyto tři cesty jsou chemicky odlišné. Jejich sloučení do jediného tvrzení, že methylenová modř funguje prostřednictvím redoxního cyklování, je hlavním důvodem, proč tolik textů o ní působí zároveň sebejistě a neurčitě.

Čtyři rozdíly, které určují, zda má tvrzení o mechanismu vůbec význam

Která forma. Redukované barvivo není zaměnitelné s oxidovaným. Inhibice acetylcholinesterázy dobře ukazuje tuto past: během dlouhé inkubace in vitro se methylenová modř postupně redukuje na svou bezbarvou formu a inhibice slábne, protože redukovaná molekula tento enzym neinhibuje. Test, který běží dostatečně dlouho na to, aby se změnila forma látky, zaznamená slabší účinek a může vést k nesprávnému vysvětlení.

Jaká koncentrace. Laboratorní rozmezí pro inhibici rozpustné guanylátcyklázy je 1 to 10 micromolar. Potlačení glutamátem zprostředkovaného přenosu v řezech potkaního hipokampu vyžadovalo 5 to 50 micromolar. Toxické účinky v buněčných kulturách jsou hlášeny nad 100 micromolar. Nejde o stejné experimenty a mechanismus potvrzený při 50 micromolar není automaticky relevantní pro pacienta, jehož plazmatická koncentrace dosahuje jen zlomku této hodnoty.

Jaký způsob podání. Absolutní perorální biologická dostupnost je kolem 72 per cent a terminální plazmatický poločas je 5 to 7 hours. Perorální podání vede k vyšším koncentracím ve střevě a játrech; intravenózní podání vede k vyšším koncentracím v mozku. Způsob podání určuje, která tkáň se s elektrony setká.

Jaký model a zda byla rozsvícena světla. Velká část mechanistické literatury vychází z buněčných kultur a studií na hlodavcích a výsledky in vitro u této molekuly závisejí na expozici světlu, membránovém potenciálu a redoxním stavu buněk, protože i lampa mikroskopu stačí k její fotosenzitizaci. Between 65 and 85 per cent podané dávky se v červených krvinkách a periferní tkáni redukuje na bezbarvou formu. Každá z těchto proměnných stojí mezi čistě popsaným mechanismem v laboratorní misce a tvrzením o člověku.

Proč je otázka čistoty otázkou chemie

Osvětlení methylenovou modř demetyluje. Prvním produktem je Azure B, potom Azure A a následně thionin, přičemž vyšší intenzita světla vede k většímu rozkladu než nižší. Molekula, jejíž užitečnost spočívá ve schopnosti přijímat a odevzdávat elektrony, je tedy zároveň molekulou, jejíž pravděpodobné produkty rozkladu jsou blízcí chemicky příbuzní, kteří zůstávají ve stejném roztoku. Složení obsahu nádoby není kosmetický detail.

Proto je pro kupujícího smysluplným kritériem shoda se specifikací USP. Produkt, který ji nesplňuje, je barvivo a barviva mohou obsahovat nečistoty, včetně Azure B, těžkých kovů a zbytkových rozpouštědel, které člověk při požití nechce přijímat. Další past představuje prodejce, který testuje pouze těžké kovy a výsledek prezentuje jako úplnou shodu. Blupreme spolupracuje s farmaceutickým výrobcem methylenové modři a testuje úplnou specifikaci: identitu, čistotu, organické nečistoty, zbytková rozpouštědla, elementární nečistoty, zbytek po žíhání, mikrobiální limity a bakteriální endotoxiny. Dokument laboratorního testování pro každou šarži je zveřejněn a výběr dodavatele je do značné míry otázkou ověření, zda tento dokument existuje a co zahrnuje.

Jeden vratný pár. Několik cest, které z něj vedou. Zvolená cesta určuje, co lze tvrdit. :::