Historie methylenové modři: od textilního barviva z roku 1876 k léčivu

Methylenová modř se dostala k pacientovi dříve než do lékárny.

Zpráva Paula Guttmanna a Paula Ehrlicha z roku 1891 o použití tohoto barviva při malárii obsahuje dva teplotní grafy. Druhý zachycuje období od 13. července do 5. srpna a podél okraje je den po dni zaznamenána léčba. Záznamy z 18. a 19. července uvádějí „1 × 0,05 Methylenblau“. V následujících dnech je uvedeno pět a sedm dávek stejného množství a do 22. července se v záznamu objevuje také malé množství chininu. Křivka horečky, která v první polovině grafu kolísá mezi 37 °C a 39.5 °C, se po nasazení barviva zplošťuje a po zbývající tři týdny zůstává přibližně mezi 36 °C a 37.5 °C.

Pacient byl jedním ze dvou mužů, které článek popisuje jako domácího sluhu a námořníka. Látka, kterou dostali, byla už patnáct let komerčním textilním barvivem a oba muži patří mezi první zaznamenané osoby léčené plně syntetickým léčivem zaměřeným na konkrétní organismus.

Nejdřív přišlo barvivo

První komerčně úspěšné syntetické barvivo vytvořil William Henry Perkin v roce 1856. Perkinovi bylo osmnáct let, během velikonočních prázdnin pracoval v domácí laboratoři a snažil se syntetizovat chinin. Místo něj získal černý zbytek, rozpustil jej a objevil barvivo, které se mimořádně dobře vázalo na hedvábí. V srpnu 1856 si jej nechal patentovat a do konce roku 1857 už jeho továrna zásobovala londýnskou barvírnu hedvábí.

V roce 1875 Adolf von Baeyer syntetizoval červené barvivo a pojmenoval je eosin podle Eos, řeckého slova pro úsvit. V roce 1876 Heinrich Caro, tehdejší ředitel laboratoře společnosti Badische Anilin- und Soda-Fabrik, společně s Baeyerem vyvinul methylenovou modř jako anilinové barvivo na bavlnu. Její chemická struktura byla definitivně určena až přibližně o devět let později.

Tento původ je stále patrný i v názvu látky. „Methylene blue“ je obchodní název z katalogu barviv, nikoli chemický popis. Látkou, kterou označuje, je methylthioninium chloride a rozdíly mezi názvem, solí a jejími hydráty začínají být důležité, jakmile někdo materiál váží nebo čte jeho specifikaci.

Barvení bylo mostem

Cesta z barvírny do nemocnice vedla přes mikroskop a začala ještě před existencí methylenové modři. Wilhelm Erb jako první použil syntetické barvivo na krev, když v roce 1865 použil kyselinu pikrovou, a uvnitř některých červených krvinek pozoroval síťovitou strukturu.

Doktorská práce Paula Ehrlicha z roku 1878 porovnávala histologické barvení s barvením textilií a tvrdila, že v obou případech jde o chemické reakce. Při práci pod vedením Roberta Kocha na tuberkulózním bacilu rozdělil anilinová barviva na kyselá a zásaditá a zjistil, že každá skupina barví jiné části buňky. V roce 1880 obě skupiny smíchal: nasycený roztok methylenové modři přiléval do kyselého fuchsinu, dokud se supernatant nevyčistil. Výsledek, který nazval neutralen Farbkörper neboli neutrální barvivo, vytvářel namísto jedné tři barvy, odhalil granula v polymorfonukleárních buňkách, která předtím nebyla viditelná, a umožnil první diferenciální rozpočet leukocytů. Protože tato granula přijímala obě složky směsi, Ehrlich pro buňky, které je nesly, vytvořil označení neutrophil.

O dva roky později použil Koch methylenovou modř k nalezení tuberkulózního bacilu a v roce 1883 Ehrlich metodu zdokonalil. V roce 1886 publikoval jiný druh pozorování: vstřikoval barvivo živým zvířatům, porovnával, jak silně je jednotlivé orgány přijímají, a dospěl k závěru, že má výraznou afinitu k mozkové a nervové tkáni. Tuto afinitu přisuzoval oxidačně-redukčnímu cyklování barviva, které pozoroval už v předchozím roce. Právě toto cyklování je také důvodem, proč roztok methylenové modři ztrácí barvu po spotřebování kyslíku a znovu ji získává po návratu vzduchu. Experimenty, které poprvé měřily důsledky tohoto cyklování patří do pozdějšího desetiletí a samotný mechanismus je samostatným tématem odlišným od historie.

Parazit a fialové jádro

Alphonse Laveran objevil parazita malárie v roce 1880 při zkoumání čerstvé, neobarvené krve. Aby jej bylo možné běžně pozorovat v zaschlém nátěru, bylo zapotřebí barvení a tehdejší metody vytvářely pouze červenou a modrou.

V roce 1888 polský patolog Czesław Cheçinski nahradil kyselý fuchsin eosinem a vytvořil směs methylenové modři a eosinu. Případ, na němž byla jeho metoda založena, se týkal vojáka, který 30. září 1887 zemřel na malárii. V krevních nátěrech Cheçinski pozoroval modré útvary připomínající sedmikrásky, dnes identifikované jako Plasmodium malariae, a srpkovité útvary, dnes rozpoznávané jako gametocyty Plasmodium falciparum. Výsledek současně ukončil dvě konkurenční interpretace onemocnění: teorii miasmatu a tvrzení Edwina Klebse a Corrada Tommasi-Crudeliho, že malárii způsobuje bakterie.

Parazit byl viditelný. Jeho jádro však ne, takže jeho povaha zůstávala nejasná. Ernst Malachowski, lékař ve Vratislavi, tento problém nejprve vyřešil náhodou a poté záměrně. V roce 1889 si v jednom preparátu všiml rozdílného obarvení plazmodiálního jádra, ale nedokázal jej zopakovat. Okyselení methylenové modři nepomohlo. Zásadité prostředí vytvořené boraxem vyvolalo efekt pokaždé. Techniku veřejně předvedl 15. června 1890 a ve stejném roce ji publikoval; podrobnější metodu zveřejnil v srpnu 1891.

Dmitri Romanowsky publikoval vlastní verzi v září 1891. Nejlepších výsledků dosáhl s opomíjenou, plesnivou lahví roztoku methylenové modři staršího než dva měsíce. Malachowského postup byl záměrný a podle jeho vlastních slov snadno reprodukovatelný; Romanowského postup byl slepou uličkou, která jednou zafungovala. Eponymum přesto připadlo Romanowskému a spor o to, kdo vytvořil fialové zbarvení, díky němuž bylo jádro viditelné je samostatný příběh s vlastními dokumenty.

Obrázek: druhý teplotní graf ze zprávy Guttmanna a Ehrlicha z roku 1891. Horní panel zachycuje období od 13. do 24. července a dolní panel od 25. července do 5. srpna; záznamy na okraji uvádějí podané dávky a během posledních tří týdnů záznamu zůstává teplota blízko normálu. Převzato ze zprávy ve skenu použitém v práci Kraftse, Hempelmanna a Skórské-Stanii, Parasitology Research* 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Ukázalo se, že zrání je demethylace

Nikdo z lidí zapojených do výzkumu v 90. letech 19. století nevěděl, co „zrání“ s methylenovou modří dělá. Odpověď přišla z průmyslové chemie. Heinrich August Bernthsen v roce 1883 syntetizoval mateřskou sloučeninu fenothiazin, v roce 1885 prokázal, že methylenová modř patří do této skupiny, a ve stejném období ukázal, že zásadité podmínky odštěpují z barviva methylové skupiny a vytvářejí sloučeniny dnes označované jako azury.

Bernard Nocht v letech 1898 a 1899 izoloval aktivní frakci a mohl ji označit pouze jako Rot aus Methylenblau, tedy červenou z methylenové modři. Michaelis ji v roce 1901 identifikoval jako azure I. Jenner v roce 1899 zavedl absolutní methanol jako rozpouštědlo sraženiny barviva, čímž odstranil nutnost fixovat krevní nátěry teplem; Leishman a Reuter oba pokroky spojili; Wright v roce 1902 publikoval zjednodušenou metodu. Giemsovým přínosem, rovněž z roku 1902, bylo opuštění náhodně vyzrálého roztoku a použití odměřených množství známých barviv. Poté odmítl zveřejnit způsob výroby čistého methylenového azuru a prodal metodu laboratoři Dr. Grüblera, která výrobek uváděla na trh jako azure I a tvrdila, že pouze její verze představuje autentické Giemsovo barvení.

Dvě světové války tento vývoj náhodou dokončily. Když německá barviva přestala být dostupná, Lillie, Roe a Wilcox začali pracovat s americkými náhradami a zjistili, že nejlepšího barvení lze dosáhnout pomocí tří oddělených složek: čisté methylenové modři, jejího rozkladného produktu azure B a eosinu. Tyto tři látky dodnes zůstávají hlavními složkami barvení používaného k diagnostice malárie pod názvem, který dnes spojuje Malachowského, Wrighta a Giemsu.

Obrázek: prstencové formy Plasmodium falciparum* v lidských červených krvinkách obarvené metodou Romanowského typu. Fialovou strukturou uvnitř prstence je chromatin, který Malachowského methylenová modř upravená boraxem poprvé zviditelnila. Obrázek Ernsta Hempelmanna, uvolněný jako volné dílo.

Jeden název, několik materiálů

Roky, během nichž se tyto složky oddělovaly, zanechaly problém, který přetrval déle než samotný chemický vývoj. Ralph Lillie v roce 1969 vymezil rozdíl mezi biologickými barvivy, „vyráběnými podle přísných specifikací odpovídajících jejich citlivému a náročnému použití“, a nebiologickými barvivy určenými k barvení textilií, která „vyžadují méně přísné a náročné výrobní standardy“. Oba druhy výrobků nesly stejný název a rozdíl mezi nimi nikdy nebyl pouze otázkou stupně kvality. Specifikace vytvořená pro bavlnu a specifikace vytvořená pro diagnostické činidlo nejsou zaměnitelné a materiál vyrobený podle textilní specifikace nebyl určen k požití.

Azure B je nejjasnějším příkladem. Jde o monodemethylovanou formu methylenové modři, má vlastní měřitelnou farmakologickou aktivitu a více než století byla nekontrolovanou složkou klinických přípravků methylenové modři, než byly obě látky odděleny. Jedna výzkumná skupina zjistila, že lidská tkáň odebraná při pitvě po podání methylenové modři obsahovala 5 až 14 procent nezměněné methylenové modři a 86 až 95 procent azure B. Zda má konkrétní přípravek azure B obsahovat a v jakém limitu, je otázkou specifikace a výzkum azure B jako nečistoty a metabolitu na ni navazuje.

Ve specifikaci se nachází také praktický důsledek. Soulad s USP je cestou k nejvyšší čistotě, kterou trh nabízí, protože USP představuje kompletní publikovaný zkušební standard, nikoli jediné měření. Zahrnuje identitu, obsah účinné látky, organické nečistoty včetně azurových barviv, reziduální rozpouštědla, elementární nečistoty, zbytek po žíhání, mikrobiální limity a bakteriální endotoxiny. Certifikát, který uvádí výsledek zkoušky těžkých kovů a označuje jej za soulad s USP, uvádí pouze jednu položku tohoto seznamu.

Blupreme získává svou methylenovou modř od farmaceutického výrobce a zveřejňuje úplný certifikát analýzy, přičemž testuje celou specifikaci USP, nikoli pouze těžké kovy. Průvodce čtením certifikátu analýzy a co označení USP dokládá a co nikoli vysvětlují, jak dokument porovnat s příslušným tvrzením.

Co historie opravňuje tvrdit a co ne

Historická linie je skutečná a delší, než naznačuje většina produktových stránek. Methylenová modř byla v roce 1891 použita při léčbě malárie, v roce 1899 byla popsána jako sedativum při agitované psychóze a její chemická vývojová větev vede přes quinakrin, chlorochin, promethazin a chlorpromazin. Ehrlichova práce z roku 1890 napsaná společně s Arthurem Leppmannem popisovala úlevu od neuralgické a revmatické bolesti a následně zvažovala, ale odmítla testování barviva u duševních onemocnění.

Nic z toho samo o sobě nedokládá moderní použití. Výsledek z roku 1891 týkající se malárie vycházel ze dvou pacientů a teplotního grafu. Dlouhá historie práce s určitou molekulou je důvodem k jejímu zkoumání, nikoli výsledkem. Historie této sloučeniny jako léčiva a moderní klinické studie u malárie odpovídají na jiné otázky, než jaké si kladl Ehrlich, a jejich cílové ukazatele je třeba posuzovat podle jejich vlastních podmínek.

V záznamech je jeden detail, který patří spíše současnosti než minulosti. Když výzkumníci v 2000s prováděli v Burkina Faso klinické studie methylenové modři u malárie, museli soutěžit o materiál farmaceutické kvality a uvedli, že cena suroviny po získání validace GMP vzrostla přibližně stonásobně. Barvivo bylo možné nahradit. Léčivo nikoli. Rozdíl, který Lillie vymezil v roce 1969, je stejným rozdílem, který dnes rozhoduje o tom, co láhev obsahuje.