Article
Tinció amb blau de metilè: mètodes de microscòpia i un atles d'imatges reals
La tinció amb blau de metilè facilita la distinció de característiques cel·lulars que, altrament, serien poc visibles en microscòpia de camp clar. Pot ajudar els estudiants a localitzar el nucli d'una cèl·lula de la mucosa bucal o a examinar el contorn i la disposició dels microorganismes. Ara bé, un objecte blau és una observació. Identificar l'organisme, mesurar-lo i decidir si indica una malaltia són tasques separades.
La imatge de portada il·lustra el principi del contrast. L'atles següent conté fotografies reals de mostres documentades de manera independent, amb la informació de les fonts originals.
Què revela el blau de metilè?
El blau de metilè és un colorant bàsic: el seu ió acolorit té càrrega positiva. Tal com explica OpenStax en l'apartat sobre la tinció de mostres, els colorants bàsics interactuen amb el material cel·lular de càrrega negativa i poden fer que les cèl·lules destaquin sobre un fons més clar. En preparacions adequades, el blau de metilè ressalta les regions riques en àcids nucleics i altres estructures que fixen el colorant.
En una tinció simple, un únic colorant proporciona contrast. Per tant, diversos organismes poden tenir un aspecte blau sense ser el mateix organisme. Les preguntes útils són, inicialment, descriptives: els objectes són rodons o allargats, aïllats o agrupats, tenyits uniformement o amb diferenciació interna? Consulta la distinció entre tinció simple i tinció de Gram abans d'interpretar el color com un resultat de classificació.
El contrast i la resolució són diferents. El contrast ajuda a distingir un objecte del seu entorn; la resolució permet separar detalls propers. Una imatge més fosca no garanteix que s'hi resolguin més estructures. Tampoc no s'ha d'identificar qualsevol grànul fosc com un orgànul.
Preparacions sense tenyir, preparacions en fresc tenyides i frotis
Una preparació en fresc sense tenyir, o nativa, permet observar la mostra sense afegir-hi colorant, tot i que extreure-la del seu entorn original ja la modifica. En una preparació en fresc tenyida, s'afegeix un reactiu mentre el material es manté en líquid sota un cobreobjectes. En un frotis fixat, el material s'estén sobre un portaobjectes i s'aplica un mètode de fixació especificat abans del processament posterior. La visió general de les preparacions d'OpenStax diferencia les preparacions en fresc de la fixació i explica per què els organismes fixats ja no permeten observar el moviment o el metabolisme normals.
Aquestes preparacions responen a preguntes diferents:
| Preparació | Observació útil | Què no pot establir la imatge per si sola |
|---|---|---|
| Preparació en fresc sense tenyir | Moviment, contorns, material visible de manera natural | La identitat només a partir del moviment o la forma |
| Preparació en fresc tenyida | Contrast entre les estructures que fixen el colorant i l'entorn | Si el reactiu ha deixat inalterada la fisiologia normal |
| Frotis fixat i tenyit | Morfologia conservada després d'una preparació definida | Com es comportava la mostra viva original |
| Mètode diferencial específic | Una reacció de tinció especificada amb controls adequats | La identitat de l'espècie o el diagnòstic sense el conjunt més ampli d'evidències del mètode |
Per fer una comparació a l'aula, registra una preparació sense tenyir abans d'examinar una preparació tenyida independent, feta segons el protocol docent. Mantén comparables la il·luminació i els paràmetres de captura d'imatges. Si es fotografien dues cèl·lules diferents, descriu-les com a exemples, no com un registre de l'abans i el després d'una mateixa cèl·lula.
Atles de microscòpia: tres mostres reals tenyides
Aquest atles és una selecció i interpretació original de tres micrografies amb llicències obertes. Els autors de les fonts identifiquen les mostres i els colorants. No hem autenticat les seves mostres de manera independent. Les imatges es reprodueixen sense retallar, convertides a WebP sense pèrdua, sense afegir-hi elements ni modificar-ne els colors.
Làmina 1: cèl·lules de la mucosa bucal humana
Mostra: cèl·lules de la mucosa bucal humana. Colorant: blau de metilè. Augment: 400×, segons el fotògraf. Barra d'escala: no disponible; la font no proporciona una mida de píxel calibrada. Fotografia de Fritzmann2002, 2017, de Cèl·lules de la mucosa bucal humana (tinció amb blau de metilè), amb llicència CC BY-SA 4.0. Aquesta reproducció conserva la mateixa llicència.
.jpg){kind=link}
Comença per una cèl·lula aïllada: el seu nucli més fosc és més fàcil de distingir del citoplasma blau que l'envolta. Després, examina les cèl·lules superposades que hi ha a sota. La superposició dificulta seguir un límit i pot crear una regió localment més fosca. Utilitza aquesta làmina per practicar el seguiment dels contorns, no per comptar cada taca fosca com un nucli. La guia d'observació de cèl·lules de la mucosa bucal desenvolupa l'exercici específic per a aquesta mostra.
Làmina 2: cèl·lules de ceba
Mostra: cèl·lules de ceba, segons la identificació de la font. Colorant: blau de metilè. Augment: “200x” apareix al nom del fitxer original; no s'ha validat de manera independent. Barra d'escala: no disponible; no es proporciona cap calibratge. Fotografia d'Alvy16, 2019, de Cèl·lula de ceba 200x, amb llicència CC BY 4.0.
Els compartiments allargats formen una capa organitzada. Compara els seus llargs límits compartits amb els contorns irregulars de la làmina 1. Fixa't també en el material fosc destacat i en la lluminositat desigual del camp. La fotografia no estableix la identitat de cada dipòsit fosc. Demostra per què un registre d'observació útil inclou els artefactes i la incertesa, en lloc d'etiquetar tot allò que capta el colorant.
Làmina 3: llevats identificats per la font com a Candida spp.
Mostra: Candida spp., segons la fotògrafa. Colorant: tinció positiva simple amb blau de metilè. Augment: no disponible. Barra d'escala: no disponible; no es proporciona una mida de píxel calibrada. Fotografia de Marta, usuària de Wikimedia Martunia.g, 2021, de Tinció positiva amb blau de metilè 2, amb llicència CC BY 4.0.
Compara les agrupacions blaves denses amb les zones perifèriques menys atapeïdes. Els contorns individuals són més fàcils de seguir on els objectes se superposen menys. El nom Candida prové del registre de la font, no d'una identificació de l'espècie feta a partir d'aquesta fotografia. Aquesta làmina tampoc no proporciona cap resultat de viabilitat. Els assajos de viabilitat i respiració de llevats requereixen condicions, controls i interpretació propis.
Interpretar correctament l'escala
Aquestes làmines permeten fer comparacions visuals, però no mesurar en micròmetres ni comparar la mida absoluta de les cèl·lules entre làmines. L'augment indicat no permet recuperar el calibratge de la càmera que falta. Canviar la mida de visualització d'una imatge en modifica l'ampliació aparent.
Per a les teves pròpies imatges, estableix un calibratge de mesura amb un patró conegut i la configuració òptica corresponent. La guia de micrometria de Nikon explica com un micròmetre de platina permet convertir divisions arbitràries d'una imatge o d'un reticle en longituds físiques. Registra l'objectiu, la configuració de la càmera i el calibratge, i afegeix una barra d'escala a partir d'aquestes dades. No dedueixis una barra d'escala a partir de la mida mitjana de les cèl·lules indicada en un llibre de text.
El flascó s'ajusta al mètode?
Un flascó etiquetat com a blau de metilè no constitueix una especificació completa de laboratori. Comprova'n la concentració i les unitats, el dissolvent, els ingredients addicionals, l'aplicació prevista, la documentació del lot i les instruccions. La fitxa de dades de seguretat d'un reactiu descriu els perills; les instruccions del mètode estableixen com utilitzar-lo per a la preparació prevista.
Un exemple concret és la solució de blau de metilè de Löffler de Merck. El fabricant la identifica com un reactiu de microscòpia i en descriu la funció com a colorant de contrast en la tinció d'àcid-alcohol resistència. La inflamabilitat indicada també mostra per què “un líquid blau” no és informació suficient per planificar-ne la manipulació o l'escalfament. Aquestes propietats corresponen a aquella formulació, no automàticament a qualsevol solució aquosa de blau de metilè.
De la mateixa manera, l'agar eosina-blau de metilè és un medi de cultiu formulat. No és una tinció per a portaobjectes feta afegint únicament blau de metilè a una mostra. Si tens un altre objectiu d'obtenció d'imatges, compara les alternatives al blau de metilè per a microscòpia.
Amb un equip de microscòpia per a principiants, comença pel mètode educatiu documentat, els portaobjectes preparats coneguts i el reactiu especificat. Si un flascó ha perdut l'etiqueta o no se'n pot establir la composició, substitueix-lo pel reactiu adequat amb la documentació corresponent. Utilitza protecció ocular i segueix les instruccions de manipulació subministrades per a la formulació concreta. El material humà i les mostres ambientals desconegudes requereixen els procediments de manipulació i eliminació de mostres del laboratori docent; la tinció no substitueix aquests procediments.
Escriu l'observació abans de la conclusió
“Objectes blaus ovalats en agrupacions” és una descripció defensable d'una imatge. “Una infecció determinada” requereix evidències que la imatge no ha proporcionat. Mantén separats al quadern la procedència de la mostra, la preparació, la reacció de tinció i el mètode d'identificació. Aquesta distinció fa que una simple imatge d'aula sigui útil i evita que una micrografia atractiva serveixi de suport a una afirmació que no pot justificar.