Com entra el blau de metilè a les cèl·lules: reducció, reoxidació i captació

Si observeu com un cultiu de cèl·lules endotelials capta blau de metilè, la interpretació més evident és també l'equivocada. El medi perd el color blau i les cèl·lules adquireixen grànuls blaus; per tant, el colorant deu haver travessat la membrana com a molècula blava. Els experiments indiquen el contrari. La forma blava gairebé no la travessa. La que la travessa és la forma incolora, i el blau que veieu a l'interior es forma a dins, després d'arribar-hi.

Aquesta inversió és important perquè determina què pot revelar la tinció i què no. Els grànuls blaus indiquen la presència de colorant oxidat que s'ha reoxidat i ha quedat retingut en orgànuls. No indiquen la quantitat total de colorant a la cèl·lula, no indiquen la fracció reduïda i no mesuren l'efecte biològic. Per entendre per què, seguiu els tres passos: reducció a la superfície, difusió de la forma reduïda, i reoxidació i retenció a l'interior.

Les dues formes es comporten com molècules diferents

El blau de metilè oxidat és un sistema d'anells pla amb càrrega positiva. Es dissol en aigua, absorbeix intensament la llum al voltant de 600 a 700 nanòmetres i té un aspecte blau. La càrrega és la clau. Una molècula carregada i hidròfila no travessa fàcilment una membrana lipídica; per això, la formulació prudent que es fa servir en la literatura és relativament impermeant a la membrana, no pas impermeant.

El blau de metilè reduït, anomenat leucoblau de metilè, és incolor, no té càrrega i és liposoluble. Si s'elimina la càrrega, la membrana deixa de ser una barrera. La molècula reduïda la travessa fàcilment per difusió i, un cop dins d'un compartiment més oxidant, pot tornar a perdre electrons i recuperar la forma blava, carregada i retinguda. La química redox del colorant és, per tant, també el seu mecanisme de transport. Si es modifica el nombre d'electrons, es modifica la permeabilitat.

Els electrons del primer pas provenen de la mateixa cèl·lula. Les cèl·lules de mamífer transporten electrons a través de la membrana plasmàtica i desplacen equivalents reductors des de donadors intracel·lulars cap a acceptors situats a la superfície. Aquesta activitat transmembrana plasmàtica és una funció cel·lular normal, present en la majoria de tipus cel·lulars, i la reductasa de la superfície endotelial que actua sobre els colorants tiazínics es comporta com altres reductases en un aspecte revelador: continua funcionant en presència de cianur i azida a dosis que aturen els passos posteriors. Aquesta separació és el punt clau de tota la història.

Primer va ser el repartiment, i gairebé va explicar la captació

El 1929, Marian Irwin, de l'Institut Rockefeller, es va plantejar una pregunta més senzilla. Potser l'entrada del colorant és només un repartiment entre l'aigua i les capes lipídiques de la cèl·lula, i una capa de cloroform pot representar aquestes capes lipídiques al laboratori. En els seus estudis espectrofotomètrics de penetració, va agitar solucions aquoses de colorant amb cloroform i va comparar allò que passava a la fase orgànica amb allò que entrava en cèl·lules vives d'algues.

Dues troballes d'aquell treball encara mereixen atenció. En primer lloc, les solucions comercials de blau de metilè contenien trimetiltionina, actualment anomenada azure B, i aquesta impuresa penetrava més ràpidament que el mateix blau de metilè, sobretot a pH alcalí, on predomina la forma de base lliure liposoluble. Una part de l'entrada aparent de blau de metilè era, en realitat, entrada selectiva d'azure B. En segon lloc, el pH determinava el resultat en determinar l'estat d'ionització, i les cèl·lules lesionades deixaven entrar molt més colorant que les intactes. Els coeficients de repartiment i l'estat de càrrega governaven allò que absorbien tant el sistema artificial com la cèl·lula viva, i la semblança entre tots dos donava suport a la idea que hi havia capes no aquoses al límit cel·lular.

El model va anticipar el paper dels lípids i la ionització, però no podia distingir entre un colorant que es reparteix sense canviar i un colorant que es transforma químicament a la superfície, travessa la membrana sota una altra forma i recupera la forma original a l'interior. Aquesta distinció requeria un experiment diferent, que va arribar setanta anys més tard en l'endoteli pulmonar.

Reducció a l'exterior, retenció a l'interior

Merker i els seus col·laboradors van treballar amb cèl·lules endotelials de l'artèria pulmonar bovina en cultiu i van proposar una seqüència de tres passos: el colorant oxidat es redueix a la superfície cel·lular a la seva forma lipòfila incolora, la forma reduïda entra per difusió i la reoxidació intracel·lular regenera la forma oxidada impermeant a la membrana, que s'acumula. A continuació, el seu estudi sobre la captació endotelial de colorants tiazínics va posar a prova la seqüència intentant interrompre-la en punts concrets.

La primera eina va ser el ferricianur, un acceptor d'electrons que no pot entrar a la cèl·lula. Quan els enzims de superfície redueixen el colorant blau a la seva forma incolora fora de la cèl·lula, el ferricianur pot recuperar aquests electrons i regenerar el colorant blau al medi abans que travessi la membrana. Mentre hi havia ferricianur en excés (10 micromolar de colorant davant de 50 a 500 micromolar de ferricianur), la captació del colorant gairebé s'aturava, i només quan el ferricianur s'havia consumit la captació es reprenia al ritme normal. La cinètica explicava el mateix d'una altra manera. El ferricianur desapareixia a un ritme aproximadament constant, coherent amb un flux estable de reducció superficial que alimentava un mediador reciclable, mentre que el colorant extracel·lular desapareixia exponencialment a mesura que se n'esgotava la reserva. Un flux constant combinat amb una reserva que s'esgota significa que el senyal del ferricianur indica reducció contínua, no pas molècules de colorant que abandonen la solució.

La segona eina eliminava del tot el pas de travessar la membrana. El grup va unir blau de toluidina O, un colorant tiazínic molt proper, a una cadena gran de poliacrilamida, massa grossa per entrar a la cèl·lula en qualsevol dels dos estats d'oxidació. Les cèl·lules continuaven reduint el colorant unit al polímer. Per tant, la reducció no requereix accés intracel·lular. La maquinària està exposada a la superfície o hi està acoblada elèctricament.

Després va arribar la separació que dona títol a l'article. El cianur i l'azida a 2 mil·limolar suprimien intensament l'acumulació del colorant i, al microscopi, les inclusions de color blau fosc i porpra que normalment envolten el nucli gairebé desapareixien. Tanmateix, cap dels dos inhibidors alentia la reducció extracel·lular: el cicle del ferricianur continuava sense disminuir i el polímer que no travessava la membrana continuava reduint-se. El bloqueig es trobava en un pas posterior. El cianur i l'azida aturaven la reoxidació i la sequestració intracel·lulars, no pas la reducció superficial. Els controls de viabilitat donaven suport a aquesta interpretació, ja que les cèl·lules retenien el seu enzim marcador citosòlic, la lactat-deshidrogenasa, durant aquests tractaments; per tant, la pèrdua de captació no era simplement conseqüència d'una intoxicació o d'una ruptura de la membrana.

Una advertència de l'article continua sent vàlida. Les inclusions blaves es trobaven al voltant del nucli, però no a dins, cosa coherent amb una oxidació dins d'orgànuls subcel·lulars, però l'estudi no va identificar quins orgànuls eren. S'havien descrit patrons semblants en altres tipus cel·lulars com a lisosomals amb poques proves. Considereu demostrada la retenció, però provisional la seva localització. Els lectors que vulguin seguir el recorregut dels electrons poden continuar amb el transport mitocondrial d'electrons i la gestió redox i amb la visió més àmplia de l'absorció i la distribució segons la via.

La tinció no és l'exposició

Un tercer estudi mostra què passa quan aquesta lògica de captació es relaciona amb una mesura biològica. Scott i els seus col·laboradors van trobar que la metil-beta-ciclodextrina, un tor de sucres en forma d'anell, s'uneix directament al blau de metilè, amb una constant d'associació d'aproximadament 310 per molar per al complex d'inclusió, en comparació amb uns 5846 per molar per a la dimerització del colorant. En fibroblasts L929, aquesta unió bloquejava tant la tinció cel·lular com l'estimulació de la captació de glucosa: la preincubació amb la ciclodextrina impedia la tinció blava, i afegir-la després accelerava la destinció. A mesura que el senyal òptic blau desapareixia de les cèl·lules, l'activació del transport de glucosa disminuïa en estret paral·lel.

Els autors van interpretar aquesta correlació com un indici favorable a una interacció directa entre el colorant i una proteïna de la via d'activació del transportador de glucosa, més que no pas a un mecanisme d'estrès oxidatiu persistent. Aquesta inferència és raonable, però té límits. L'experiment no identifica la proteïna, no demostra la unió al mateix transportador, i la correlació entre la destinció i la pèrdua de l'efecte no permet excloure totes les vies mediades per processos redox.

La lliçó que perdura té a veure amb el mesurament. La tinció òptica indica colorant visible, oxidat i associat a les cèl·lules. No detecta gens la fracció reduïda incolora; per això, una cèl·lula pàl·lida encara pot contenir equivalents de colorant, i una cèl·lula intensament tenyida indica colorant oxidat retingut, no pas l'exposició tissular total ni la magnitud de l'efecte. La mateixa precaució s'aplica a una escala més gran: comparar la tinció entre tipus cel·lulars o considerar un tall de teixit fosc com a prova d'una exposició més elevada repeteix l'error inicial del cultiu. La captació és un cicle de reducció, difusió i reoxidació, i qualsevol instantània de la forma blava només en mostra una part. Les conseqüències pràctiques per a la tinció i la manipulació al laboratori i per a la interpretació d'afirmacions sobre dosi i exposició se'n deriven directament.