Article
Blau de metilè i leucoblau de metilè: un parell redox, dos colors
Una estudiant afegeix unes gotes de colorant blau a un matràs, el fa girar suaument i observa com el color desapareix. Agita el matràs i el blau torna. Entre els dos estats no s'ha afegit ni retirat res, llevat d'electrons i del contacte amb l'aire. Aquest matràs conté tot el tema d'aquest article: el blau de metilè i la seva forma reduïda, el leucoblau de metilè, que s'interconverteixen en un parell redox reversible en què el color és la lectura.
La qüestió pràctica va primer. Aquí, el canvi de color no és un efecte secundari. És el senyal analític. Qualsevol persona que formuli amb blau de metilè, el faci servir en valoracions o l'utilitzi per ensenyar hauria de poder escriure la semireacció de memòria, indicar les condicions que la desplacen cap a l'esquerra o cap a la dreta i anomenar les impureses que desdibuixen el resultat.
El parell en una equació
El blau de metilè oxidat és el catió metiltionini: un sistema pla de fenotiazini amb sofre i nitrogen a l'anell central i un grup dimetilamino a cada extrem, subministrat com a sal de clorur. PubChem el registra com a clorur de metiltionini, C.I. Basic Blue 9. En aigua, el monòmer absorbeix prop de 664 nm, cosa que dona el blau que percep l'ull.
El leucoblau de metilè reduït (LMB) té el mateix esquelet, amb el nitrogen de l'anell central protonat i el cromòfor interromput. No té càrrega a pH gairebé neutre i és pràcticament incolor, amb una absorbància negligible en el visible i una banda ultraviolada intensa prop de 258 nm (entrada de PubChem per al leucoblau de metilè, CAS 613-11-6). El nombre de protons de la semireacció depèn del pH, perquè la forma reduïda es protona en medi àcid (valors aproximats de pKa prop de 4.5 i 5.8). Tres règims cobreixen l'interval pràctic:
MB(+) + 2 e(-) + H(+) <=> LMB, blau <=> incolor (pH gairebé neutre, 1 protó)
MB(+) + 2 e(-) + 2 H(+) <=> LMBH(+), blau <=> incolor (moderadament àcid, 2 protons)
MB(+) + 2 e(-) + 3 H(+) <=> espècie leuco doblement protonada (fortament àcid, 3 protons)
Les tres expressions descriuen el mateix parell en diferents estats de protonació, un aspecte que la bibliografia sobre el comportament redox dels colorants tiazínics tracta sistemàticament. La dependència del pH segueix l'equació de Nernst per a Ox + mH(+) + 2e(-) <=> Red, amb un pendent d'aproximadament 29.6, 59.2 o 88.7 mV per unitat de pH per a m = 1, 2 o 3. Els pendents mesurats prop de 28, 58 i 87 mV per unitat de pH confirmen l'assignació; per tant, un potencial indicat sense el seu pH no té sentit.
Què diu l'equació a qui formula
De l'estequiometria se'n desprenen tres fets. Primer, dos electrons per molècula significa que el blau de metilè és un indicador i mediador de dos electrons, no un transportador d'un sol electró, en la seva reacció neta. Segon, hi participen protons, de manera que el potencial formal varia amb el pH tal com s'ha descrit més amunt. Tercer, el potencial formal a pH 7 se situa prop de +0.011 V respecte de l'elèctrode estàndard d'hidrogen (aproximadament +0.53 V a pH 0), cosa que situa el parell entre els oxidants suaus: prou fort per acceptar electrons de bons donadors com el NAD(P)H o l'ascorbat, i prou feble per cedir-los a l'oxigen dissolt o a centres fèrrics. Aquesta posició intermèdia és precisament el motiu pel qual el colorant completa cicles en lloc de quedar-se bloquejat en un extrem.
La concentració afegeix una altra complicació. Per sobre d'aproximadament cent micromolars en aigua, en consonància amb una constant de dissociació monòmer-dímer publicada d'entre 170 i 250 uM a pH 7, el catió oxidat s'apila formant dímers i agregats superiors, amb una banda d'absorció desplaçada cap a 610 a 615 nm. Per tant, un espectre amb el pic desplaçat pot indicar agregació, no pas impureses. Primer diluïu i després valoreu.
Condicions que afavoreixen cada sentit
La taula següent és la referència per al treball de laboratori. La reducció necessita un donador d'electrons; la reoxidació necessita un acceptor d'electrons, i normalment n'hi ha prou amb l'aire.
| Sentit | Reactiu o condició | Què passa | Notes |
|---|---|---|---|
| Reducció | Glucosa en solució alcalina | El blau s'esvaeix en repòs | El sistema clàssic de l'ampolla blava; l'agitació amb aire restitueix el color |
| Reducció | Àcid ascòrbic | El blau s'esvaeix | Base de les demostracions del rellotge de vitamina C i de valoració |
| Reducció | Ditionit de sodi | Decoloració ràpida i completa | Reductor fort per al treball analític; cal excloure l'aire després |
| Reducció | NAD(P)H amb un catalitzador o enzim adequat | El blau s'esvaeix | Modelitza la via de reducció biològica |
| Reducció | Zinc en àcid clorhídric | Decoloració en medi fortament àcid | Via preparativa per obtenir la forma leuco |
| Oxidació | Agitació amb aire o oxigen pur | La forma incolora torna a ser blava | L'O2 dissolt és l'oxidant habitual; la demostració de reversibilitat a l'aula |
| Oxidació | Ió fèrric, persulfat o dicromat | Retorn ràpid al blau | Oxidants forts per a una reoxidació quantitativa |
Totes les entrades obeeixen la mateixa equació. Només canvia la força impulsora. És en aquest sentit que el parell és reversible: el camí és el mateix, recorregut en sentits oposats sota condicions oposades.
L'ampolla blava, explicada
Aquesta demostració mereix una explicació clara del mecanisme perquè representa el parell en miniatura. En una solució alcalina de glucosa, la base afavoreix l'enolització de la glucosa i l'enediolat resultant redueix el blau de metilè a leucoblau de metilè, de manera que el contingut del matràs es torna incolor. L'agitació dissol l'oxigen de l'espai de cap, l'oxigen reoxida la forma leuco i el blau torna. En repòs, l'oxigen dissolt prop de la zona de reacció superficial s'esgota i la glucosa torna a dominar. El cicle es repeteix fins que la glucosa es consumeix, i cada agitació és una equació de Nernst visible: augmenteu l'activitat de l'oxidant i l'equilibri es desplaça cap al blau.
El radical intermedi
La reacció neta transfereix dos electrons, però les etapes elementals els transfereixen d'un en un. Entre el catió blau i la forma leuco incolora hi ha un intermedi radicalari semiquinònic que, majoritàriament, es desproporciona per tornar a formar el parell en lloc d'acumular-se. El seu potencial d'un electró, prop de menys 0.23 V a pH 7, queda molt per sota del potencial de punt mitjà net de dos electrons, i per això el radical continua sent una espècie minoritària en estat estacionari. És important per dos motius. Sota il·luminació, el colorant assoleix estats excitats que obren vies radicalàries; per això les solucions de blau de metilè són sensibles a la llum i la fotoquímica ha de formar part de qualsevol protocol d'estabilitat. A més, a concentracions elevades, la forma oxidada es dimeritza, cosa que modifica l'espectre i la cinètica aparent sense canviar el parell subjacent. Cap d'aquests fets trenca la reversibilitat. Tots dos expliquen observacions que, altrament, semblen indicar irreversibilitat.
Els compostos relacionats desmetilats desplacen l'escala
Si s'eliminen grups metil dels dos braços dimetilamino, el parell es manté, però amb propietats desplaçades. El màxim d'absorció es desplaça de manera monòtona cap al blau amb cada desmetilació: blau de metilè prop de 664 nm, Azure B prop de 654, Azure A prop de 630, Azure C prop de 615 i tionina prop de 600 nm. Azure B, al qual li falta un grup metil, és el compost més proper: un metabòlit principal del blau de metilè i una impuresa documentada en el material de blau de metilè. Azure A i Azure C continuen la sèrie amb el mateix esquelet redox actiu. La tionina, amb els dos grups amino completament desmetilats, se situa a l'extrem amb un potencial formal prop de +0.06 V a pH 7, davant dels +0.011 V del blau de metilè, i és apreciablement més fàcil de reduir. Els potencials redox de la sèrie depenen del medi i de l'elèctrode; per tant, compareu els valors només dins d'un mateix conjunt de condicions. Per això, la caracterització del perfil d'impureses és una qüestió redox, no només una casella de puresa per marcar. Un petit percentatge d'Azure B significa un petit percentatge d'un parell redox diferent a l'ampolla, i Azure B com a impuresa i metabòlit documenta com es controla aquesta fracció.
On intervé la biologia
Dins d'un glòbul vermell, el NADPH redueix el blau de metilè a leucoblau de metilè, i la forma leuco transfereix electrons al ferro fèrric de l'hem, restaurant l'estat ferrós de l'hemoglobina. Aquesta transferència d'electrons és la base química de l'ús del blau de metilè en la metahemoglobinèmia adquirida. Tot el que ve després d'aquesta transferència, el metabolisme energètic, el flux d'electrons mitocondrial i qualsevol resultat biològic, correspon al transport d'electrons mitocondrial i es deixa deliberadament per a aquell article.
Compreu el parell, no només el color
La qualitat d'un colorant redox depèn de la seva especificació. Una puresa elevada és important perquè el blau de metilè que no compleix USP sol ser de grau tèxtil i contenir Azure B, metalls pesants o dissolvents residuals que desplacen les lectures redox i desdibuixen els punts finals, aspectes que cap protocol de tinció no comprova. La majoria de venedors que afirmen complir USP només analitzen els metalls pesants i donen la feina per feta. El compliment complet inclou identitat, valoració, impureses orgàniques, dissolvents residuals, impureses elementals, residu d'incineració, límits microbians i endotoxines bacterianes, i com triar blau de metilè de grau farmacèutic explica com llegir aquesta documentació. Blupreme treballa amb un fabricant farmacèutic de blau de metilè, verifica tota l'especificació USP i publica el COA complet. Quan el color és la mesura, aquesta documentació forma part de l'instrument.