Eksperimenti koji su povezali metilensko plavilo s ćelijskim disanjem

Defibrinirana ljudska krv, zagrijavana na 37 °C tokom tri sata, potroši oko dva posto kisika koji sadrži. Ako se prije inkubacije doda mala količina metilenskog plavila, ista krv potroši oko šezdeset pet posto. U ćelijama se ništa nije promijenilo. Promijenila se samo otopina.

Taj podatak potječe iz rada koji su 1928. objavili George Harrop i E. S. Guzman Barron na Univerzitetu Johns Hopkins, a iz njega je proizašla često ponavljana tvrdnja da metilensko plavilo poboljšava ćelijsko disanje. Tvrdnja nije netačna, ali joj je značenje uže nego što zvuči.

Šta broj u tabeli zapravo mjeri

Mjereni ishod bio je utrošak kisika, određen analizom gasova. Harrop i Barron filtrirali su svježe uzetu krv kroz vatu na 10 °C kako bi uklonili bijele krvne ćelije, zasitili uzorak kisikom, podijelili ga, u jedan dio dodali boju i nakon inkubacije analizirali oba dijela. Broj leukocita rijetko je prelazio približno hiljadu po kubnom milimetru. Potrošnja kisika iskazana je kao udio početnog sadržaja kisika u uzorku koji je nestao.

Mjerili su i ugljendioksid, ali tu je metoda stvarala poteškoće. Defibrinirana krv oslobađala je do dva milimola ugljendioksida po 100 mL u prvom satu inkubacije iz razloga nevezanih za ispitivanu reakciju, pa su respiratorni kvocijenti iz pune krvi bili neupotrebljivi. Samo su isprane ćelije u Lockeovoj otopini davale rezultate koji su se mogli tumačiti, a oni su se grupirali između 0.73 i 0.80, i s bojom i bez nje.

Taj detalj nije nevažan. „Disanje“ u ovim radovima znači razmjenu gasova u zatvorenoj posudi. Razlika između potrošnje kisika i proizvodnje korisne energije zasebno se razmatra u članku šta potrošnja kisika govori, a šta ne govori o ATP-u.

Boja je najviše povećavala potrošnju tamo gdje su ćelije najmanje disale

Zreli eritrociti sisara gotovo da nemaju mjerljivu potrošnju kisika. Eritrociti ptica, koji imaju jedro, imaju je. Harrop i Barron ispitivali su obje vrste, a razlika među njima čini osnovu njihovog argumenta.

U uzorcima sisara boja je izazvala povećanja od dvadeset do pedeset puta. U krvi guske, čije su ćelije već disale, brzina se nikada nije povećala više od dva puta. Što je početno disanje bilo veće, to je boja manje mogla povećati njegovu brzinu.

Isti obrazac pojavljuje se i unutar jedne vrste. Uzorak ljudske krvi pacijenta s policitemijom verom, koji je sadržavao nezrele ćelije, potrošio je 11.3 posto svog kisika bez prisustva boje, naspram 2.8 posto za isprane ćelije zdravog davaoca. Boja je tu potrošnju povećala samo na 63.4 posto, što je šesterostruko ubrzanje, dok su normalne ćelije ubrzale gotovo trideset puta. Boja je ponašanje zrelih ćelija približila ponašanju nezrelih, upravo kako su autori opisali njen učinak.

Cijanid je to trebao zaustaviti

Bilo je poznato da cijanid zaustavlja ćelijsku oksidaciju. Harrop i Barron ipak su ga dodali zajedno s bojom.

Rezultati za goveđu krv reprezentativni su. Bez dodataka, sadržaj kisika pao je s 22.61 na 22.03 volumnih posto tokom tri sata. S metilenskim plavilom pao je na 12.84. S metilenskim plavilom i kalijevim cijanidom u molarnoj koncentraciji od jedne petohiljaditine pao je na 12.74. Učinak boje ostao je praktično nepromijenjen.

Slika: kontinuirani zapis mikrorespiracije ljudskih eritrocita. Strelica označava dodavanje metilenskog plavila. Prije toga krivulja je gotovo ravna; nakon toga postojano raste. Preuzeto iz rada Harropa i Barrona, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Zaključili su da boja djeluje kao prenosilac kisika, „nadomještajući supstancu koja je nestala iz zrelih eritrocita sisara bez jedra“. Dvije godine kasnije, Michaelis i Salomon na Institutu Rockefeller formulirali su neslaganje koje je ostalo do danas. Učinak boje bio je ili „slučajno svojstvo boje“ ili je boja bila „model neke nepoznate supstance u organizmima“. Ta dilema nije razriješena. Promijenilo se to što se ćelije danas mogu opisati mnogo preciznije.

Ekstrakt jetre imao je isti učinak

Michaelis i Salomon pokazali su da ekstrakti organa dobiveni hladnom vodom izazivaju istu stimulaciju. Jetra štakora imala je najjači učinak, a slijedili su bubreg, slezena i testis. Mozak, mišić i krvni serum imali su mali učinak ili ga nisu imali.

Zatim su ispitali ekstrakt u prisustvu ugljenmonoksida. Disanje izazvano ekstraktom ili bojom ostalo je nepromijenjeno u mješavini od 98 posto ugljenmonoksida i 2 posto kisika. Ista gasna mješavina inhibirala je disanje kvasca i eritrocita peradi s jedrom za približno 60 do 80 posto, u skladu s Warburgovim opisom respiratornog fermenta osjetljivog na ugljenmonoksid. Neidentificirana tkivna supstanca, prema tome, nije bila Warburgov enzim.

Tokom istraživanja odbačeno je nekoliko mogućih identiteta te supstance. Reducirani glutation i cistein izazivali su samo potrošnju kisika potrebnu za njihovu vlastitu oksidaciju. Koenzim Hardena i Younga isključen je jer ga mišić sadrži najviše, a pokazivao je gotovo najmanji učinak. Keilinov citohrom, nazvan nekoliko godina ranije, naišao je na istu proturječnost. Vlastitu pretpostavku da aktivna supstanca potječe iz ćelijskog jedra nazvali su tek pretpostavkom.

Učinak je zavisio od određenih uslova

Ćelije su morale biti očuvane. Hemoliza izazvana destiliranom vodom ili ponovljenim zamrzavanjem ukidala je odgovor i na boju i na ekstrakt, a djelimična hemoliza smanjivala ga je proporcionalno svom obimu.

Bio je potreban i šećer. Glukoza, fruktoza i saharoza podržavale su disanje izazvano bojom; manitol nije. Bez prisustva šećera nije bilo nikakvog disanja, a činilo se da boja pritom oštećuje ćelije, pa ga glukoza dodana jedan ili dva sata kasnije nije obnovila. Autori su pretpostavili da boja oksidira strukturnu komponentu potrebnu ćeliji.

Osvjetljenje je znatno povećavalo učinak boje, iako je učinak bio jasno prisutan i u mraku. Druge boje koje se mogu reducirati ponašale su se drugačije: toluilensko plavilo imalo je jednak ili veći učinak od metilenskog plavila, dok indigo-disulfonat nije imao gotovo nikakav učinak. Nije utvrđena jasna veza između oksidacijsko-redukcijskog potencijala boje i veličine njenog učinka, što su autori pripisali propusnosti membrane i toksičnosti.

Učinak je pratio fermentaciju, a ne disanje

Barron je u istraživanju iz 1930. prešao sa suspenzija ćelija na tkivne presjeke normalnih organa štakora i transplantiranih tumora.

U tkivima bez aerobne glikolize metilensko plavilo nije imalo učinka ili je blago smanjivalo potrošnju kisika: u bubregu za oko 14 posto, u gušterači za oko 14 posto, u jetri za oko 5 posto. U tkivima koja fermentiraju u prisustvu kisika povećavalo je potrošnju: u slezeni za oko 8 posto, u mozgu za oko 13 posto. Povećanja u tumorima kretala su se od oko 27 posto u ljudskom karcinomu dojke do više od 80 posto u Rousovom sarkomu kokoši, približno proporcionalno aerobnoj glikolizi svakog tkiva.

Slika: svaka tačka predstavlja jednu vrstu tkiva. Horizontalna osa prikazuje aerobnu glikolizu; vertikalna osa prikazuje promjenu potrošnje kisika nakon dodavanja metilenskog plavila. Podaci iz rada Barrona, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), tabela 6, PMID 19869777.

Eksperiment s cijanidom zatim je dao obrnutu sliku. Kada je disanje u tim prethodno neosjetljivim tkivima blokirano cijanidom i fermentacija došla do izražaja, boja je ponovo povećala potrošnju kisika: u bubregu za oko 59 posto, u jetri za oko 19 posto, u slezeni za oko 286 posto, u testisu za oko 200 posto.

Barron je predložio da bi boja mogla služiti kao test fermentativnog kapaciteta ćelije ili tkiva, a rad je završio nagađanjem: uzastopne generacije tumorskih kultura u podlozi koja sadrži boju možda bi jednog dana mogle učiniti metabolizam tumora trajno sličnim metabolizmu normalnog tkiva. To je bilo istraživačko pitanje napisano 1930. godine. Nije tvrdnja o liječenju.

Šta eksperimenti nisu mogli mjeriti

Godine 1928. i 1930. „disanje“ je značilo potrošnju kisika. Adenozin-trifosfat prvi put je opisan 1929., a dokaz da izolirane mitohondrije esterificiraju fosfat dok prenose elektrone objavljen je 1949. Nijedan od ranih radova o metilenskom plavilu nije mogao mjeriti proizvodnju energije i nijedan nije tvrdio da je mjeri.

Ćelije su drugi problem. Zreli eritrociti sisara ne sadrže mitohondrije. Tokom stadija retikulocita uklanjaju mitohondrije i ribosome selektivnom autofagijom, zbog čega zrela crvena krvna ćelija dobiva energiju glikolizom, a o svom pentoza-fosfatnom putu zavisi uglavnom zbog NADPH-a, a ne ATP-a. U eksperimentima iz 1928. nije bio prisutan lanac transporta elektrona koji bi se mogao popraviti. Šta god da je trošilo kisik, obavljalo je neki drugi proces.

Danas je prilično dobro opisano o kakvom se procesu radilo. Metilensko plavilo prihvata elektrone od ćelijskih redukcijskih ekvivalenata i postaje leukometilensko plavilo, koje molekularni kisik ponovo oksidira, čime se ciklus zatvara. U ljudskim crvenim krvnim ćelijama korak redukcije obavljaju flavin-reduktaza zavisna od NADPH-a i srodne disulfid-reduktaze. Istraživanje iz 1976. s obilježenom glukozom utvrdilo je da boja stimulira heksoza-monofosfatni put, da učinak pri niskoj koncentraciji zavisi od oksihemoglobina i da viša koncentracija, 0.1 mM, stvara vodikov peroksid. Reducirana boja u dodiru s kisikom proizvodi peroksid, a ne fosfatne veze.

U mitohondrijama je slika spornija nego što popularni sažeci priznaju. Jedan pravac istraživanja tvrdi da boja preuzima elektrone iz područja kompleksa I i predaje ih citohromu c. Drugo istraživanje utvrdilo je da u mitohondrijama mišjeg mozga ne može obnoviti disanje nakon blokade antimicinom te je mjesto prihvatanja elektrona smjestilo na vezno mjesto za ubikinol u kompleksu III. Treće je utvrdilo da niske koncentracije povećavaju potrošnju kisika u mirovanju, dok disanje stimulirano ADP-om ostaje nepromijenjeno. Najizravniji iskaz o tome glasi da potrošnja kisika izazvana metilenskim plavilom uopće ne zavisi od oksidativne fosforilacije: održala se kada je respiratorni lanac bio inhibiran i u preparatima bez njega.

Postoje i direktna mjerenja razlike između te dvije veličine. U izoliranim mitohondrijama jetre štakora povećavanje koncentracije boje smanjivalo je omjere respiratorne kontrole i izazivalo bubrenje, što su autori opisali kao razdvajanje oksidacije i fosforilacije. U perfundiranoj jetri štakora metilensko plavilo povećavalo je potrošnju kisika, dok je omjer ATP-a prema ADP-u padao.

Klinički podaci nose istu poruku. Methemoglobinemija se liječi približno jednim do dva miligrama metilenskog plavila po kilogramu intravenski, putem redukcijskog puta zavisnog od NADPH-a, a veće doze izazivaju stanje koje se liječi. Isti pregledni rad navodi da je antidotski učinak najveći u očuvanim eritrocitima i smanjen kada je prisutna hemoliza, što je nalaz o hemolizi iz 1930. koji se sedamdeset tri godine kasnije ponovo pojavljuje u bolničkom kontekstu. Spoju čiji se korisni i štetni učinci nalaze na suprotnim stranama praga doze ne treba određivati dozu na osnovu mjerenja potrošnje kisika.

Zašto je proizvodna serija dio rasprave

Harrop i Barron primijetili su nešto što vrijedi ponovo pročitati. Samo metilensko plavilo stvara traku u spektroskopu između dvije karakteristične trake methemoglobina, „što lako može dovesti do zabune pri površnom pregledu“. Boja može oponašati supstancu koja se traži.

Isti problem ima i hemijski oblik. Srodni fenotiazin prisutan kao sporedni sastojak ima vlastito redoks ponašanje, vlastitu propusnost i vlastitu toksičnost. Jedan dokumentirani slučaj pokazuje konkretne posljedice: u istraživanju jodiranja metilenskog plavila uzorci koji su sadržavali približno 7 do 8 posto Azure B proizvodili su uglavnom jodirani Azure B, pa je reakcijom dominirala nečistoća, a ne metilensko plavilo.

Svako ko koristi metilensko plavilo kao reagens, u laboratoriji, na radnom mjestu za bojenje ili u akvariju, radi sa sastojkom čiji sastav nije precizno određen ako proizvodna serija nije karakterizirana. Srodne supstance, identitet, elementarne nečistoće, rezidualni rastvarači i ostatak nakon žarenja dio su eksperimenta, a ne samo prateća dokumentacija. Blupreme nabavlja svoje metilensko plavilo od farmaceutskog proizvođača i objavljuje potpuni certifikat analize, uz ispitivanje prema cjelokupnoj USP specifikaciji, a ne samo na teške metale; vodič za čitanje certifikata analize i članak šta oznaka kvaliteta prema USP-u potvrđuje, a šta ne potvrđuje objašnjavaju kako provjeriti odgovara li dokument tvrdnji.

Broj je bio tačan

Eksperimenti iz 1928. i 1930. bili su pažljivo provedeni, a njihovo glavno zapažanje opstalo je: boja koja se može reducirati može navesti ćeliju koja gotovo ne diše da troši kisik višestruko brže nego u mirovanju, bez prolaska kroz korak koji cijanid blokira.

Greška se pojavljuje kasnije, kada se „disanje“ tumači u njegovom savremenom značenju. Mjerenje razmjene gasova govori da su elektroni stigli do kisika. Ne govori da je ijedan od njih iskorišten za stvaranje ATP-a, a u ćeliji bez mitohondrija razlika između te dvije tvrdnje najveća je moguća. Širi pregled djelovanja metilenskog plavila u ćelijama smješta istu razliku u širi kontekst, a historija tog spoja od boje do lijeka objašnjava kako je boja za tekstil uopće dospjela u ove eksperimente.