Опитите, които свързаха метиленовото синьо с клетъчното дишане

Дефибринирана човешка кръв, държана при 37 °C в продължение на три часа, консумира около два процента от съдържащия се в нея кислород. Ако преди инкубацията се добави малко количество метиленово синьо, същата кръв консумира около шестдесет и пет процента. Нищо в клетките не се е променило. Променил се е само разтворът.

Тази стойност идва от публикация от 1928 г. на Джордж Хароп и Е. С. Гусман Барон от университета „Джонс Хопкинс“ и е източникът на широко повтаряното твърдение, че метиленовото синьо подобрява клетъчното дишане. Твърдението не е невярно, но обхватът му е по-тесен, отколкото изглежда.

Какво всъщност измерва числото в таблицата

Измерваният показател е поглъщането на кислород, определено чрез газов анализ. Хароп и Барон филтрират прясно взета кръв през памук при 10 °C, за да отстранят белите кръвни клетки, насищат пробата с кислород, разделят я, добавят багрило към едната част и анализират двете след инкубация. Броят на левкоцитите рядко надхвърля около хиляда на кубичен милиметър. Консумацията на кислород е отчетена като дела от първоначалното кислородно съдържание на пробата, който е изчезнал.

Измерват и въглеродния диоксид, но при него методът създава затруднения. През първия час на инкубацията дефибринираната кръв отделя до два милимола въглероден диоксид на 100 mL по причини, несвързани с изследваната реакция, затова дихателните коефициенти от цяла кръв са неизползваеми. Само промити клетки в разтвор на Лок дават стойности, които могат да се интерпретират, и те се групират между 0.73 и 0.80 както с багрилото, така и без него.

Тази подробност не е маловажна. „Дишане“ в тези публикации означава газообмен в затворен съд. Разликата между консумацията на кислород и получаването на използваема енергия е разгледана отделно в какво показва и какво не показва консумацията на кислород за ATP.

Багрилото добавя най-много там, където клетките дишат най-малко

Зрелите еритроцити на бозайниците почти нямат измерима консумация на кислород. Еритроцитите на птиците, които имат ядра, консумират кислород. Хароп и Барон изследват и двата вида, а контрастът е в основата на аргументацията им.

В пробите от бозайници багрилото предизвиква увеличения от двадесет до петдесет пъти. В гъша кръв, чиито клетки вече дишат, то никога не увеличава скоростта повече от два пъти. Колкото по-високо е изходното дишане, толкова по-малко може да добави багрилото.

Същата зависимост се наблюдава и в рамките на един вид. Човешка проба от пациент с истинска полицитемия, съдържаща незрели клетки, консумира 11.3 процента от кислорода си без багрило, спрямо 2.8 процента за промити клетки от здрав донор. Багрилото повишава стойността само до 63.4 процента — шесткратно ускорение, докато при нормалните клетки ускорението е почти тридесеткратно. Багрилото приближава поведението на зрелите клетки до това на незрелите, точно както твърдят авторите.

Цианидът би трябвало да го спре

Известно е, че цианидът спира клетъчното окисление. Въпреки това Хароп и Барон го добавят заедно с багрилото.

Резултатите с говежда кръв са показателни. Без добавки кислородното съдържание спада от 22.61 до 22.03 обемни процента за три часа. С метиленово синьо то спада до 12.84. С метиленово синьо и калиев цианид с моларна концентрация една петхилядна то спада до 12.74. Ефектът на багрилото остава практически непроменен.

Фигура: непрекъснат микрореспирометричен запис на човешки еритроцити. Стрелката отбелязва добавянето на метиленово синьо. Преди него кривата е почти хоризонтална; след това се изкачва равномерно. Възпроизведено от Хароп и Барон, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Заключението им е, че багрилото действа като преносител на кислород, „доставяйки вещество, което е изчезнало от зрелите безядрени еритроцити на бозайниците“. Две години по-късно Михаелис и Саломон от института „Рокфелер“ формулират разногласието по начин, който остава актуален. Или ефектът на багрилото е „случайно свойство на багрилото“, или то е „модел на някакво неизвестно вещество в организмите“. Тази дилема не е разрешена. Променило се е това, че днес клетките могат да бъдат описани много по-точно.

Екстракт от черен дроб прави същото

Михаелис и Саломон показват, че студени водни екстракти от органи предизвикват същото стимулиране. Най-силен е ефектът на черния дроб от плъх, следван от бъбрек, слезка и тестис. Мозъкът, мускулите и кръвният серум имат слаб или никакъв ефект.

След това проверяват действието на екстракта при наличие на въглероден оксид. Дишането, предизвикано от екстракта или от багрилото, остава непроменено в смес от 98 процента въглероден оксид и 2 процента кислород. Същата газова смес потиска дишането на дрожди и на ядрените еритроцити на кокошки с приблизително 60 до 80 процента, в съответствие с описанието на Варбург за чувствителен към въглероден оксид дихателен фермент. Следователно неидентифицираното тъканно вещество не е ензимът на Варбург.

В хода на работата отпадат няколко предположения за неговата идентичност. Редуцираният глутатион и цистеинът предизвикват само консумацията на кислород, необходима за собственото им окисление. Коензимът на Хардън и Йънг е изключен, защото мускулите съдържат най-много от него, а показват почти най-слабия ефект. Цитохромът на Кейлин, получил името си няколко години по-рано, се сблъсква със същото противоречие. Собственото си предположение, че активното вещество произхожда от клетъчното ядро, авторите определят като само предположение.

Ефектът зависи от определени условия

Клетките трябва да са цели. Хемолизата чрез дестилирана вода или многократно замразяване премахва отговора както към багрилото, така и към екстракта, а частичната хемолиза го намалява пропорционално.

Необходима е и захар. Глюкозата, фруктозата и захарозата поддържат предизвиканото от багрилото дишане; манитолът не го поддържа. Без захар изобщо няма дишане, а багрилото изглежда уврежда клетките в процеса, така че добавянето на глюкоза един или два часа по-късно не го възстановява. Авторите предполагат, че багрилото окислява структурен компонент, необходим на клетката.

Осветяването значително усилва ефекта на багрилото, макар че той ясно се наблюдава и на тъмно. Други багрила, които могат да се редуцират, се държат различно: толуиленовото синьо достига или надхвърля ефекта на метиленовото синьо, докато индигодисулфонатът почти не действа. Не се установява ясна връзка между окислително-редукционния потенциал на дадено багрило и размера на ефекта му, което авторите отдават на мембранната пропускливост и токсичността.

Ефектът следва ферментацията, а не дишането

Изследването на Барон от 1930 г. преминава от клетъчни суспензии към тъканни срезове от нормални органи на плъхове и трансплантирани тумори.

В тъкани без аеробна гликолиза метиленовото синьо няма ефект или леко потиска консумацията на кислород: при бъбрек с около 14 процента, при панкреас с около 14 процента, при черен дроб с около 5 процента. В тъкани, които ферментират в присъствието на кислород, то увеличава консумацията: при слезка с около 8 процента, при мозък с около 13 процента. Увеличенията при туморите варират от около 27 процента при човешки карцином на гърдата до над 80 процента при сарком на Раус при кокошка, приблизително пропорционално на аеробната гликолиза във всяка тъкан.

Фигура: всяка точка представлява един вид тъкан. Хоризонталната ос показва аеробната гликолиза; вертикалната ос — промяната в консумацията на кислород след добавяне на метиленово синьо. Данни от Барон, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), таблица 6, PMID 19869777.

След това опитът с цианид дава огледален резултат. Когато дишането в тези дотогава неотговарящи тъкани е блокирано с цианид и ферментацията се проявява, багрилото отново увеличава консумацията на кислород: при бъбрек с около 59 процента, при черен дроб с около 19 процента, при слезка с около 286 процента, при тестис с около 200 процента.

Барон предлага багрилото да служи като тест за ферментативната способност на клетка или тъкан и завършва с предположение: поколения туморни култури в среда, съдържаща багрило, може един ден да направят метаболизма на тумора трайно подобен на този на нормална тъкан. Това е изследователски въпрос, формулиран през 1930 г. Не е твърдение за лечение.

Какво тези опити не биха могли да измерват

През 1928 и 1930 г. „дишане“ означава консумация на кислород. Аденозинтрифосфатът е описан за първи път през 1929 г., а доказателството, че изолирани митохондрии естерифицират фосфат, докато пренасят електрони, идва през 1949 г. Нито една от ранните публикации за метиленовото синьо не би могла да измерва производството на енергия и нито една не твърди, че го прави.

Клетките са вторият проблем. Зрелите еритроцити на бозайниците не съдържат митохондрии. През ретикулоцитния стадий те отстраняват митохондриите и рибозомите чрез селективна автофагия, поради което зрелите червени кръвни клетки разчитат на гликолизата, а пентозофосфатният им път е необходим главно за NADPH, а не за ATP. В опитите от 1928 г. няма електроннотранспортна верига, която да бъде възстановена. Каквото и да е консумирало кислорода, то е извършвало нещо друго.

Днес това друго действие е сравнително добре описано. Метиленовото синьо приема електрони от клетъчни редуциращи еквиваленти и се превръща в левкометиленово синьо, което се окислява отново от молекулен кислород, затваряйки цикъла. В човешките червени кръвни клетки NADPH-зависимата флавинредуктаза и сродни дисулфидредуктази извършват редукционната стъпка. Изследване от 1976 г. с белязана глюкоза установява, че багрилото стимулира хексозомонофосфатния шънт, че ефектът при ниска концентрация зависи от оксихемоглобина и че по-висока концентрация, 0.1 mM, образува водороден пероксид. При среща с кислород редуцираното багрило произвежда пероксид, а не фосфатни връзки.

При митохондриите картината е по-спорна, отколкото признават популярните обобщения. Едно направление в изследванията поддържа, че багрилото приема електрони от областта на комплекс I и ги предава на цитохром c. Друго установява, че в митохондрии от мозък на мишка то не може да възстанови дишането след блокиране с антимицин, и вместо това локализира мястото на приемане на електрони в участъка за свързване на убихинол в комплекс III. Трето установява, че ниски концентрации повишават консумацията на кислород в покой, без да променят стимулираното от ADP дишане. Най-прякото формулиране на този извод е, че предизвиканата от метиленово синьо консумация на кислород изобщо не зависи от окислителното фосфорилиране: тя се запазва при инхибирана дихателна верига и в препарати без такава.

Съществуват и преки измервания на разликата между двете величини. В изолирани митохондрии от черен дроб на плъх увеличаващите се концентрации на багрилото понижават коефициентите на дихателен контрол и предизвикват набъбване, което авторите описват като разпрягане на окислителното фосфорилиране. В перфузиран черен дроб на плъх метиленовото синьо повишава консумацията на кислород, докато съотношението ATP към ADP спада.

Клиничните данни носят същото послание. Метхемоглобинемията се лекува с приблизително един до два милиграма метиленово синьо на килограм интравенозно чрез NADPH-зависим редукционен път, а по-големи дози причиняват състоянието, което се лекува. Същият обзор отбелязва, че антидотният ефект е най-силен при цели еритроцити и намалява при наличие на хемолиза — наблюдението за хемолизата от 1930 г. се появява отново седемдесет и три години по-късно в болничен контекст. Съединение, чиито полезни и вредни ефекти се намират от противоположните страни на дозов праг, не е съединение, чиято доза трябва да се извежда от измерване на консумацията на кислород.

Защо партидата е част от обсъждането

Хароп и Барон забелязват нещо, което заслужава повторен прочит. Самото метиленово синьо образува ивица в спектроскопа между двете характерни ивици на метхемоглобина, „което лесно може да доведе до объркване при бегъл оглед“. Багрилото може да имитира веществото, което се търси.

Същият проблем има и химична форма. Сроден фенотиазин, присъстващ като второстепенна съставка, има собствено окислително-редукционно поведение, собствена пропускливост и собствена токсичност. Един документиран случай показва конкретно значението на това: в изследване на йодирането на метиленово синьо проби, съдържащи приблизително 7 до 8 процента Azure B, дават предимно йодиран Azure B, така че реакцията е доминирана от примеса, а не от метиленовото синьо.

Всеки, който използва метиленово синьо като реактив — в лаборатория, на работна маса за оцветяване или в аквариум — работи с неуточнена съставка, ако партидата не е характеризирана. Сродните вещества, идентичността, елементните примеси, остатъчните разтворители и остатъкът след накаляване са част от опита, а не придружаваща го документация. Blupreme получава метиленовото си синьо от фармацевтичен производител и публикува пълен сертификат за анализ, като извършва изпитвания по цялата спецификация на USP, а не само за тежки метали; ръководството за разчитане на сертификат за анализ и какво удостоверява и какво не удостоверява обозначението за качество по USP обясняват как да се провери дали документът подкрепя твърдението.

Числото е било вярно

Опитите от 1928 и 1930 г. са проведени внимателно и основното им наблюдение е издържало проверката на времето: багрило, което може да се редуцира, може да накара клетка, която почти не диша, да консумира кислород с многократно по-висока скорост от тази в покой, без да преминава през стъпката, която цианидът блокира.

Грешката се появява по-късно, когато „дишане“ се разбира в съвременния му смисъл. Измерването на газообмена показва, че електрони са достигнали до кислорода. То не показва, че някои от тях са били използвани за образуване на ATP, а в клетка без митохондрии разликата между тези две твърдения е възможно най-голяма. По-широкият обзор на действието на метиленовото синьо в клетките поставя същото разграничение в по-широк контекст, а историята на съединението от багрило до лекарство обяснява как едно текстилно багрило изобщо стига до тези опити.