История на метиленовото синьо: от текстилно багрило през 1876 г. до лекарство

Метиленовото синьо стига до пациент, преди да стигне до аптека.

Докладът от 1891 г. на Paul Guttmann и Paul Ehrlich за употребата на багрилото при малария съдържа две температурни графики. Втората обхваща периода от 13 юли до 5 август, като приложеното лечение е записано по полето ден по ден. Записите за 18 и 19 юли гласят „1 × 0,05 Methylenblau“. За следващите дни са отбелязани пет и седем дози от същото количество, а до 22 юли в записа се появява и малко количество хинин. Температурната линия, която през първата половина на графиката се колебае между 37 °C и 39.5 °C, се изравнява след появата на багрилото и през оставащите три седмици се задържа между около 36 °C и 37.5 °C.

Пациентът е един от двама души, описани в публикацията като домашен прислужник и моряк. Съединението, което получават, дотогава е било търговско текстилно багрило в продължение на петнадесет години, а двамата мъже са сред първите документирани хора, лекувани с изцяло синтетично лекарство, насочено към конкретен организъм.

Багрилото е първо

Първото синтетично багрило с търговски успех е създадено от William Henry Perkin през 1856 г. Perkin е на осемнадесет години, работи в домашна лаборатория по време на великденската ваканция и се опитва да синтезира хинин. Вместо това получава черен остатък, разтваря го и открива цвят, който се фиксира ярко върху коприна. Патентова го през август 1856 г., а до края на 1857 г. вече има фабрика, която снабдява лондонско предприятие за боядисване на коприна.

През 1875 г. Adolf von Baeyer синтезира червено багрило и го нарича еозин, от Eos, гръцката дума за зора. През 1876 г. Heinrich Caro, тогава директор на лабораторията в Badische Anilin- und Soda-Fabrik, разработва заедно с Baeyer метиленовото синьо като анилиново багрило за памук. Химичната му структура е установена едва около девет години по-късно.

Този произход все още личи в начина, по който веществото се назовава. „Methylene blue“ е търговско наименование от каталога за багрила, а не химично описание. Съединението, за което се отнася, е methylthioninium chloride, а разликите между името, солта и нейните хидрати стават важни веднага щом някой претегля материала или чете спецификация.

Оцветяването е мостът

Пътят от производството на багрила до болницата минава през микроскопа и започва още преди появата на метиленовото синьо. Wilhelm Erb е първият човек, който прилага синтетично багрило върху кръв, използвайки пикринова киселина през 1865 г., и наблюдава мрежест модел във вътрешността на някои червени кръвни клетки.

Докторската дисертация на Paul Ehrlich от 1878 г. сравнява хистологичното оцветяване с боядисването на текстил и твърди, че и двете представляват химични реакции. Докато работи при Robert Koch върху туберкулозния бацил, той разделя анилиновите багрила на киселинни и основни класове и установява, че всеки клас оцветява различни части на клетката. През 1880 г. смесва двата вида: наситен разтвор на метиленово синьо се излива в кисел фуксин, докато супернатантът се избистри. Полученото, което той нарича neutralen Farbkörper или неутрално оцветяване, дава три цвята вместо един, разкрива гранули в полиморфонуклеарните клетки, които преди това не са били видими, и прави възможно първото диференциално броене на левкоцити. Тъй като тези гранули поемат и двата компонента на сместа, Ehrlich въвежда думата неутрофил за клетките, които ги съдържат.

Две години по-късно Koch използва метиленово синьо, за да открие туберкулозния бацил, а през 1883 г. Ehrlich подобрява метода. През 1886 г. той публикува наблюдение от различен тип: инжектира багрилото на живи животни и сравнява доколко силно го поема всеки орган, като стига до извода, че то има изразен афинитет към мозъчната и нервната тъкан. Той приписва този афинитет на окислително-редукционния цикъл на багрилото, който е наблюдавал през предходната година. Същият цикъл е причината разтворът на метиленово синьо да губи цвета си, когато кислородът му се изчерпи, и да го възстановява при повторен достъп на въздух. Експериментите, които за първи път измерват последствията от този цикъл, принадлежат към по-късно десетилетие, а самият механизъм е отделна тема от историята.

Паразитът и лилавото ядро

Alphonse Laveran открива маларийния паразит през 1880 г., като изследва прясна, неоцветена кръв. За рутинното му наблюдение в изсушена натривка е необходимо оцветяване, а използваните по това време методи дават само червено и синьо.

През 1888 г. полският патолог Czesław Cheçinski заменя киселия фуксин с еозин и създава смес от метиленово синьо и еозин. Случаят, върху който е разработен методът му, е на войник, починал от малария на 30 септември 1887 г. В кръвните натривки Cheçinski вижда сини форми, наподобяващи маргаритки, днес разпознавани като Plasmodium malariae, и сърповидни форми, днес разпознавани като гаметоцитите на Plasmodium falciparum. Резултатът слага край едновременно на две конкуриращи се обяснения за заболяването: теорията за миазмите и твърдението на Edwin Klebs и Corrado Tommasi-Crudeli, че маларията се причинява от бактерия.

Паразитът е видим. Ядрото му не е, което оставя естеството му неизяснено. Ernst Malachowski, лекар в Breslau, решава проблема първо случайно, а след това целенасочено. През 1889 г. забелязва диференциално оцветяване на плазмодиалното ядро в препарат, но не успява да го възпроизведе. Подкиселяването на метиленовото синьо не помага. Алкализирането му с боракс възпроизвежда ефекта всеки път. Той демонстрира техниката публично на 15 юни 1890 г. и я публикува същата година, а през август 1891 г. представя по-пълен метод.

Dmitri Romanowsky публикува собствена версия през септември 1891 г. Най-добрите му резултати идват от пренебрегната, мухлясала бутилка с разтвор на метиленово синьо на повече от два месеца. Описанието на Malachowski е целенасочено и, по собствените му думи, лесно възпроизводимо; това на Romanowsky е задънена улица, която сработва веднъж. Въпреки това епонимът остава за Romanowsky, а спорът кой е получил лилавия цвят, който прави ядрото видимо, е отделна история със собствени документи.

Фигура:** втората температурна графика от доклада на Guttmann и Ehrlich от 1891 г. Горният панел обхваща периода от 13 до 24 юли, а долният — от 25 юли до 5 август; записите по полето посочват приложените дози, а температурата остава близо до нормалната през последните три седмици от записа. Възпроизведено от доклада във вида, сканиран за Krafts, Hempelmann и Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Узряването се оказва деметилиране

Никой от участниците през 1890-те години не знае какво причинява „узряването“ на метиленовото синьо. Отговорът идва от промишлената химия. Heinrich August Bernthsen синтезира изходното съединение фенотиазин през 1883 г., установява през 1885 г., че метиленовото синьо принадлежи към това семейство, и през същия период показва, че алкалните условия отстраняват метилови групи от багрилото, като образуват съединенията, които днес се наричат azures.

Bernard Nocht извлича активната фракция през 1898 и 1899 г. и може да я нарече само Rot aus Methylenblau — червено от метиленово синьо. Michaelis я идентифицира като azure I през 1901 г. Jenner въвежда абсолютен метанол като разтворител за утайката от багрилото през 1899 г., което премахва необходимостта кръвните натривки да се фиксират чрез нагряване; Leishman и Reuter съчетават двете подобрения; Wright публикува опростен метод през 1902 г. Приносът на Giemsa, също от 1902 г., е да спре да разчита на случайно узрял разтвор и вместо това да използва измерени количества известни багрила. След това той отказва да публикува как получава чист methylene azure и продава метода на лабораторията на Dr. Grübler, която предлага продукта като azure I и твърди, че само нейната версия е автентично оцветяване по Giemsa.

Две световни войни довършват процеса по случайност. Когато германските багрила стават недостъпни, Lillie, Roe и Wilcox работят върху американските заместители и установяват, че най-доброто оцветяване се получава от три отделни компонента: чисто метиленово синьо, неговия продукт на разграждане azure B и еозин. Тези три вещества остават основните компоненти на оцветяването, използвано днес за диагностициране на малария, под име, което вече обединява Malachowski, Wright и Giemsa.

Фигура:** пръстеновидни форми на Plasmodium falciparum в човешки червени кръвни клетки, оцветени с метод от типа Romanowsky. Лилавата структура вътре в пръстена е хроматинът, който обработеното с боракс метиленово синьо на Malachowski прави видим за първи път. Изображение от Ernst Hempelmann, предоставено като обществено достояние.

Едно име, няколко различни материала

Годините, през които тези компоненти са били разграничавани, оставят проблем, който надживява самата химия. През 1969 г. Ralph Lillie прокарва разграничението между биологични оцветители, „произвеждани по строги спецификации, съответстващи на техните деликатни и взискателни приложения“, и небиологични оцветители за текстил, които „изискват по-малко строги и взискателни производствени стандарти“. И двата вида продукт носят едно и също име, а разликата между тях никога не е била просто въпрос на степен. Спецификация, написана за памук, и спецификация, написана за диагностичен реагент, не са взаимозаменяеми, а материал, произведен по текстилната спецификация, не е предназначен за поглъщане.

Azure B е най-ясната илюстрация. То е монометилирано надолу производно на метиленовото синьо, има собствена измерима фармакологична активност и повече от век присъства като неконтролиран компонент в клинични препарати с метиленово синьо, преди някой да раздели двете вещества. Една изследователска група установява, че човешка тъкан, взета при аутопсия след приложение на метиленово синьо, съдържа 5 до 14 процента непроменено метиленово синьо и 86 до 95 процента azure B. Дали даден препарат трябва да съдържа azure B и каква трябва да бъде допустимата граница е въпрос на спецификация, а изследванията на azure B като примес и метаболит продължават темата оттам.

Именно в спецификацията се намира и практическото следствие. Съответствието с USP е пътят към най-високата чистота, която пазарът предлага, защото USP представлява пълен публикуван стандарт за изпитване, а не единично измерване. Той обхваща идентичност, анализ, органични примеси, включително azure багрилата, остатъчни разтворители, елементни примеси, остатък след накаляване, микробиологични граници и бактериални ендотоксини. Сертификат, който отчита резултат за тежки метали и го нарича съответствие с USP, е отчел само един ред от този списък.

Blupreme получава своето метиленово синьо от фармацевтичен производител и публикува пълния сертификат за анализ, като се изпитва цялата спецификация на USP, а не само тежките метали. Ръководството за четене на сертификат за анализ и какво обозначението USP установява и какво не установява обясняват как документът да бъде проверен спрямо твърдението.

Какво позволява да се заключи историята и какво не

Историческата линия е реална и е по-дълга, отколкото подсказват повечето продуктови страници. Метиленовото синьо е използвано за лечение на малария през 1891 г., описано е като седатив при възбудена психоза през 1899 г., а страничната му химична верига преминава през quinacrine, chloroquine, promethazine и chlorpromazine. Публикацията на Ehrlich от 1890 г. с Arthur Leppmann описва облекчаване на невралгична и ревматична болка, след което разглежда, но решава да не изпитва багрилото при психични заболявания.

Нищо от това не установява съвременна употреба. Резултатът от 1891 г. при малария се основава на двама пациенти и температурна графика. Дългогодишното познаване на една молекула е причина тя да бъде изследвана, а не резултат само по себе си. Историята на съединението като лекарство и съвременните изпитвания при малария отговарят на различни въпроси от тези, които Ehrlich е задавал, и крайните показатели трябва да се разглеждат според собствените им критерии.

В документите има една подробност, която принадлежи повече на настоящето, отколкото на миналото. Когато през 2000-те години изследователи провеждат изпитвания на метиленово синьо при малария в Burkina Faso, се оказва, че трябва да се конкурират за материал с фармацевтично качество, и съобщават, че цената на суровината се е повишила с коефициент около сто, след като е получила GMP валидиране. Багрилото може да бъде заменено. Лекарството — не. Разграничението, което Lillie прави през 1969 г., е същото, което и днес определя какво съдържа една бутилка.