Метыленавы сіні і мітахондрыі: транспарт электронаў і доказы

Уявіце два прэпараты побач. Абодва ўтрымліваюць мітахондрыі мозгу, атручаныя ротэнонам — рэчывам, якое блакуе комплекс I дыхальнага ланцуга. У адзін з іх эксперыментатар піпеткай дадае метыленавы сіні ў мікрамалярнай канцэнтрацыі. Спажыванне кіслароду часткова аднаўляецца. Мембранны патэнцыял часткова вяртаецца. Зноў пачынаецца сінтэз невялікай колькасці ATP. У суседняй кювеце датчык перакісу паказвае другую палову карціны: выпрацоўка перакісу вадароду ўзрасла ў некалькі разоў пры кожнай выпрабаванай дозе і з кожным выпрабаваным субстратам.

Абодва паказанні правільныя. Метыленавы сіні — гэта пераносчык электронаў, які можа падтрымліваць іх паток у абыход пашкоджанага ўчастка дыхальнага ланцуга, але за гэты ж перанос даводзіцца плаціць утварэннем перакісу. Калі адначасова ўлічваць абодва факты, літаратура пра ўплыў метыленавага сіняга на мітахандрыяльную функцыю становіцца зразумелай. Калі ўлічваць толькі адзін, яна падаецца аповедам пра цуд або пагрозу — у залежнасці ад таго, які артыкул вы адкрылі першым.

Простае тлумачэнне пераносу

Дыхальны ланцуг — гэта эстафета. Электроны паступаюць у комплекс I (ад NADH) або ў комплекс II і звязаныя з ім флавінавыя ферменты (ад сукцынату і падобных донараў), праходзяць праз комплекс III да рухомага пераносчыка — цытахрому c, а затым праз комплекс IV да кіслароду. Кожная перадача перапампоўвае пратоны праз унутраную мембрану, а атрыманы градыент забяспечвае сінтэз ATP. Калі заблакаваць любую станцыю, папярэдні ўчастак ланцуга спыняецца.

Метыленавы сіні ўключаецца ў гэты працэс як паралельны кур’ер. Яго акісленая форма прымае электроны ад пераносчыкаў вышэй па ланцугу і ператвараецца ў бясколерную адноўленую форму — лейкаметыленавы сіні. Тая перадае электроны далей па ланцугу і зноў становіцца сіняй. Гэтыя дзве формы апісаны ў тлумачэнні акісляльна-аднаўленчай пары, а больш шырокія аспекты пераносу — у агульным тлумачэнні механізму. Адкрытым застаецца пытанне, дзе кур’ер вяртаецца ў ланцуг: у кішэні звязвання хінолу комплексу III, вядомай як Qo-сайт, або непасрэдна на цытахроме c. Які з гэтых шляхоў пераважае, залежыць ад умоў, што падрабязна разглядаецца ў аналізе абыходу комплексу III.

Што насамрэч вымяралі ў трох даследаваннях на грызунах

Ва ўсіх трох даследаваннях выкарыстоўвалі ізаляваныя мітахондрыі мозгу — арганелы, вынятыя з клеткі і змешчаныя ў буферны раствор зададзенага складу. Ніякіх інтактных клетак, ніякіх жывёл, якім уводзілі рэчыва, ніякіх удзельнікаў-людзей. Канцэнтрацыі адносяцца да асяроддзя вакол арганел, а не да дозы для прыёму чалавекам унутр. Калі не выходзіць за гэтыя рамкі, лічбы гавораць ясна.

Першае даследаванне, праведзенае на ізаляваных мітахондрыях мозгу марской свінкі пры канцэнтрацыях ад 100 нанамалярных да 2 мікрамалярных, выявіла і карысць, і выдаткі ў адным прэпараце. У здаровых мітахондрыях фарбавальнік павялічваў спажыванне кіслароду ў стане спакою, але не змяняў дыханне, стымуляванае ADP, таму выпрацоўка ATP, спалучаная з дыханнем, не паляпшалася. Пры блакадзе комплексу I канцэнтрацыя 2 мікрамалярныя аднаўляла сінтэз ATP з 46 да 93 нанамоляў за хвіліну на міліграм пры нармальнай хуткасці каля 1109. Пры блакадзе комплексу III тая ж доза павялічвала выпрацоўку ATP прыкладна з 46 да 63 пры нармальнай хуткасці каля 910. Мембранны патэнцыял і паглынанне кальцыю часткова аднаўляліся. Блакаду комплексу IV цыянідам абысці не ўдалося, што змяшчае карысны пункт выхаду электронаў перад працаздольным комплексам IV. Кожнае частковае аднаўленне было статыстычна значным і невялікім: адназначныя працэнты ад нармальнай выпрацоўкі ATP.

Другое даследаванне, праведзенае на мітахондрыях кары мозгу мышэй пры канцэнтрацыі каля 1 мікрамалярнай, пацвердзіла абыход комплексу I і вызначыла мяжу на ўзроўні комплексу III. Ротэнон зніжаў дыханне прыкладна са 121 да менш чым 2 нанамоляў кіслароду за хвіліну на міліграм, а фарбавальнік павялічваў яго прыкладна да 21 — прыблізна адной шостай нармальнага ўзроўню, тады як мембранны патэнцыял аднаўляўся амаль цалкам. Але пасля блакады комплексу III ні дыханне, ні патэнцыял не аднаўляліся ў дыяпазоне ад 1 да 5 мікрамалярных, а блакада падаўляла сігнал перакісу, выкліканы фарбавальнікам. Аўтары выказалі меркаванне, што адноўлены фарбавальнік перадае свае электроны ў Qo-сайце комплексу III: калі гэты сайт заняты, кур’еру няма куды іх даставіць.

Трэцяе даследаванне, праведзенае на мітахондрыях мозгу мышэй, пацукоў і марскіх свінак пераважна пры канцэнтрацыі 2 мікрамалярныя, непасрэдна праверыла гэтую супярэчнасць і паказала, што блакаду комплексу III можна абысці. Калі інгібітар Qo-сайта міксатыязол зніжаў базальнае дыханне на 88 працэнтаў, фарбавальнік аднаўляў спажыванне кіслароду прыкладна да 62 працэнтаў ад хуткасці без блакады. У прамым выпрабаванні канцэнтрацыя паўмікрамалярная прыводзіла да аднаўлення экзагеннага цытахрому c нават пры заблакаваным комплексе III. Гэта падтрымлівае існаванне шляху ад NADH праз фарбавальнік да цытахрому c і далей да комплексу IV. Але адноўленае дыханне паводзіла сябе ненармальна: дадаванне ADP зніжала спажыванне кіслароду замест таго, каб павялічваць яго, а блакаванне сінтэзу ATP стымулявала дыханне. Мембранны патэнцыял аднаўляўся толькі часткова. Высокае спажыванне кіслароду пры інвертаваным спалучэнні працэсаў — гэта не нармальная вытворчасць энергіі.

Чаму вынікі лабараторый разыходзяцца і што гэта тлумачыць

Першым адпадае тлумачэнне праз відавыя адрозненні. Трэцяя група паўтарыла працу на трох відах грызуноў і атрымала якасна аднолькавы абыход ва ўсіх, у тым ліку ў той лініі мышэй, для якой раней паведамлялі пра адсутнасць абыходу. Насамрэч адрозніваюцца канцэнтрацыі (1 супраць 2 мікрамалярных), дозы інгібітараў, буферы, метады ізаляцыі і, найперш, энергетычны стан, у якім праводзіцца параўнанне: абыход найбольш выразны да дадавання ADP — менавіта там, дзе ўзнікае парадаксальная рэакцыя на ADP. Таму карэктная схема паказвае два залежныя ад умоў пункты выхаду: адзін у Qo-сайце, другі на цытахроме c. Кур’ер дастаўляе электроны туды, куды дазваляюць мясцовыя хімічныя ўмовы.

Плата перакісам

Дадзеныя пра выдаткі гэтак жа паслядоўныя, як і дадзеныя пра частковае аднаўленне функцыі. У працы на марскіх свінках фарбавальнік павялічваў выдзяленне перакісу ва ўсіх выпрабаваных умовах: у стане спакою, пры сінтэзе ATP і пры хімічна выкліканым парушэнні функцыі, з усімі трыма субстратамі. Падчас сінтэзу ATP выпрацоўка ўзрастала прыкладна са 148 да больш чым 1500 пікамоляў за хвіліну на міліграм пры канцэнтрацыі 1 мікрамалярная, а нават 100 нанамалярных павялічвалі сігнал больш чым у чатыры разы. Фарбавальнік таксама запавольваў выдаленне перакісу прыкладна ў 2.6 раза, таму сігнал адлюстроўвае і паскарэнне ўтварэння, і запаволенне выдалення. Прапанаваны хімічны механізм — непасрэднае аднаўленне кіслароду адноўленым фарбавальнікам без выяўленага супераксіду, хоць гэта застаецца інтэрпрэтацыяй, а не даказаным этапам.

Праца на мышах ускладняе карціну карысным чынам. Выпрацоўка перакісу рэзка ўзрастала з дозай: ад зыходнага ўзроўню каля 76 да амаль 2000 пікамоляў за хвіліну на міліграм пры канцэнтрацыі 2 мікрамалярныя. Аднак блакада комплексу III падаўляла кампанент, выкліканы фарбавальнікам. Калі б перакіс утвараўся толькі праз рэакцыю адноўленага фарбавальніка з кіслародам, блакаванне ланцуга не павінна было б так моцна ўплываць. Але яно ўплывае, значыць, ланцуг удзельнічае ў працэсе. Агляд антыаксідантных і прааксідантных уласцівасцей змяшчае гэтую дваістасць у шырэйшы кантэкст, а аналіз суадносін кіслароду і ATP тлумачыць, чаму адных паказчыкаў кіслароду ніколі не дастаткова для высновы пра энергію.

Частковае аднаўленне функцыі — не ліквідацыя пашкоджанняў

Фраза, ад якой варта адмовіцца, — «ці аднаўляе метыленавы сіні мітахондрыі». Ліквідацыя пашкоджанняў азначала б устойлівае выпраўленне: адбудаваныя комплексы, спалучэнне працэсаў, якое захоўваецца пасля выдалення прэпарату, аднаўленне ў інтактных клетках, а затым паляпшэнне функцыі ў жывым арганізме. Ніводная з трох прац гэтага не паказвае. Яны паказваюць хуткае перанакіраванне электронаў у свежаізаляваных арганелах падчас штучнай хімічнай блакады, з выпрацоўкай ATP на ўзроўні невялікіх доляў ад нормы і часам з відавочна дзіўным спалучэннем працэсаў. Ротэнон і антыміцын — лабараторныя інструменты, а не мадэлі старэння або мітахандрыяльных захворванняў чалавека. Нішто з гэтага не азначае больш энергіі для здаровага чалавека: гэта асобнае пытанне доказаў са сваёй літаратурай даследаванняў на людзях.

Тры абмежаванні дазваляюць рабіць сумленныя высновы для біяхакінгу. Па-першае, канцэнтрацыя ў асяроддзі — не доза: ад 0.1 да 2 мікрамалярных вакол ізаляваных арганел нічога не кажуць пра тое, якая колькасць пры прыёме ўнутр забяспечыць такую свабодную канцэнтрацыю каля мітахондрыі мозгу чалавека, асабліва таму, што назапашванне або вызваленне фарбавальніка залежыць ад самога мембраннага патэнцыялу. Па-другое, кісларод — не энергія: фарбавальнік можа павялічваць спажыванне кіслароду як праз цыклічныя рэакцыі і ўцечку электронаў, так і праз прадуктыўнае фасфарыляванне. Таму рэспіраметрыя без вымярэння ATP і мембраннага патэнцыялу не дае падстаў для сцвярджэнняў пра энергію. Па-трэцяе, карысць і нагрузка павінны згадвацца ў адным сказе: любое сцвярджэнне пра аднаўленне патэнцыялу або ATP, якое замоўчвае адначасовы рост перакісу, недакладна перадае вынікі эксперымента. Да звязаных удакладненняў належаць акісляльна-аднаўленчы баланс NAD, форма залежнасці адказу ад дозы і кіраўніцтва па выбары метадаў аналізу.

Адна практычная заўвага: перанос электронаў — уласцівасць менавіта гэтай малекулы. Дэметыляваныя роднасныя злучэнні, такія як Azure B, таксама акісляльна-аднаўленча актыўныя, але паводзяць сябе інакш. Таму часткова дэградаваны раствор — гэта ўжо іншы эксперымент у параўнанні з непашкоджаным фарбавальнікам. Гэта адна з прычын патрабаваць адпаведнасці поўнай фармакапейнай спецыфікацыі і апублікаванага дакумента на партыю, а не толькі праверкі на металы. Хімічныя працэсы пад уздзеяннем святла дадаюць яшчэ адну агаворку для прымянення пры асвятленні; яна разглядаецца ў матэрыяле пра спалучэнні з чырвоным святлом.

Пасля ўсіх гэтых удакладненняў вузкае сцвярджэнне застаецца абгрунтаваным і вартым захавання: метыленавы сіні можа пры пэўных умовах дзейнічаць як кур’ер электронаў у пашкоджаных ізаляваных мітахондрыях, часткова падтрымліваючы паток коштам утварэння перакісу. Усё астатняе — энергія, даўгалецце, ліквідацыя пашкоджанняў — чакае доказаў, якія гэтыя даследаванні ад пачатку не былі прызначаныя даць.