Paul Ehrlich và xanh methylen: một thuốc nhuộm đã góp phần định hình việc khám phá thuốc như thế nào

Đóng góp của Paul Ehrlich cho y học không phải là một loại thuốc. Đó là một lập luận về cách xem xét một loại thuốc.

Năm 1878, ông nộp một luận án tiến sĩ có phần mở đầu mang tên "Quan niệm hóa học về nhuộm màu." Luận điểm của phần này là nhuộm một lát cắt mô và nhuộm một mảnh vải tuân theo cùng một nguyên lý. Trong cả hai trường hợp, màu bám vào do ái lực hóa học giữa thuốc nhuộm và vật liệu, chứ không phải vì mô có tính thấm hút, chứa chất béo hay có hình dạng giữ được sắc tố. Ehrlich lớn lên trong lúc quan sát người anh họ của mình, nhà bệnh lý học Karl Weigert, chuẩn bị các lát cắt nhuộm màu; điều thu hút ông không phải là những hình ảnh mà là việc thuốc nhuộm chọn nơi nó đi đến.

Nhận định ấy nghe có vẻ khiêm tốn. Nhưng không phải vậy. Nếu một thuốc nhuộm gắn vào mô vì lý do hóa học, thì kiểu phân bố màu nhuộm là thông tin về hóa học của mô đó. Một tiêu bản nhuộm màu không còn chỉ là hình minh họa mà trở thành một phép đo.

Ông lập tức phát triển ý tưởng này. Năm 1880, ông kết hợp xanh methylen với fuchsin acid và gọi hỗn hợp này là một thuốc nhuộm trung tính, một chất màu trung tính, có thể phân biệt các loại bạch cầu khác nhau mà những thuốc nhuộm đơn lẻ đang được dùng khi ấy không làm được. Hai năm sau, ông trình bày một phương pháp dùng tím methyl để nhuộm trực khuẩn lao, và Koch đã áp dụng quy trình này trong công trình của mình.

Lý thuyết sau này tạo nền tảng chung cho những thực hành ấy là một vấn đề riêng, và mốc thời gian của nó thường bị giản lược. Lý thuyết chuỗi bên của Ehrlich, tức ý tưởng rằng một chất tác động lên tế bào vì hai bên tương thích về mặt hóa học, thuộc về thập niên 1890, không phải những năm ông nghiên cứu thuốc nhuộm. Công trình trước đó cung cấp niềm tin tiền đề: tính chọn lọc có bản chất hóa học, và vì vậy có thể chủ động tìm kiếm tính chọn lọc thay vì tình cờ bắt gặp nó.

Thí nghiệm biến thuốc nhuộm thành bản đồ

Năm 1885, Ehrlich xuất bản một chuyên khảo về nhu cầu oxy của cơ thể, với phụ đề là một nghiên cứu phân tích bằng màu sắc. Phương pháp của ông là tiêm những thuốc nhuộm có màu phụ thuộc vào trạng thái oxy hóa, rồi so sánh cách các cơ quan khác nhau khử hoặc giữ nguyên chúng. Thuốc nhuộm được dùng như một dụng cụ đo, tương tự nhiệt kế: nó phản ánh những điều kiện bên trong mô mà không thể khảo sát trực tiếp. Chính Ehrlich mô tả mục tiêu là xác định khả năng khử của các cơ quan sống với sự trợ giúp của những thuốc nhuộm cụ thể.

Kết quả với xanh methylen xuất hiện năm 1886, trong một bài báo về phản ứng của thuốc nhuộm với chất thần kinh sống, đã được đọc trước một hội y khoa vào tháng 12 năm trước. Xanh methylen được đưa vào hệ tuần hoàn của một động vật sống, sau đó các lát mô mỏng được lấy ra và tiếp xúc với không khí để lượng thuốc nhuộm không màu đã tích tụ bị oxy hóa trở lại thành màu xanh, cho thấy nơi nó tập trung. Các tế bào thần kinh và sợi thần kinh bắt màu, với tính chọn lọc đủ rõ để kỹ thuật này trở thành phương pháp tiêu chuẩn nhằm hiển thị mô thần kinh. Hợp chất ấy không còn chỉ là chất tạo màu được bôi lên một lát cắt chết trên bàn thí nghiệm. Nó là một chất đánh dấu tự phân bố bên trong cơ thể sống, và sự phân bố ấy có thể được đọc ra.

Đặc tính làm nền tảng cho cả hai thí nghiệm cần được nêu rõ, vì mọi điều khác trong câu chuyện này đều phụ thuộc vào nó. Xanh methylen có thể chuyển đổi thuận nghịch. Dạng khử của nó, xanh leucomethylen, không có màu; khi tiếp xúc với oxy, nó trở lại dạng cation màu xanh. Dung dịch glucose chứa thuốc nhuộm này trong một lọ kín không có màu; mở lọ ra thì dung dịch chuyển sang xanh. Có ghi nhận rằng Ehrlich đã trực tiếp minh họa điều này bằng cách xử lý các lát cắt nhuộm màu với clorua sắt cũng như với không khí, rồi quan sát màu xuất hiện trở lại. Một thuốc nhuộm đổi màu theo trạng thái oxy hóa-khử của môi trường xung quanh là một đầu dò cho môi trường ấy.

Như vậy, hai đặc tính tồn tại song song. Một thuốc nhuộm có thể phân biệt mô này với mô khác. Và một thuốc nhuộm có thể được bật hoặc tắt màu nhờ sự thay đổi trạng thái oxy hóa.

Nhìn ngược lại từ hiện tại, đặc tính thứ hai là khởi đầu của hóa trị liệu. Nếu một hợp chất gắn vào loại mô này mà không gắn vào loại mô khác, thì chính hợp chất đó có thể tiếp cận loại sinh vật này mà không tiếp cận loại sinh vật khác. Ehrlich nêu trực tiếp suy luận ấy: nếu một tác nhân gây bệnh có thể được nhuộm một cách chọn lọc, thì việc nhuộm màu có thể báo hiệu một tác động gây hại đặc hiệu lên tác nhân đó. Vì vậy, một thuốc nhuộm có thể được dùng làm thuốc, nhắm vào kẻ xâm nhập thay vì bệnh nhân.

Thử nghiệm đầu tiên trên bệnh nhân không dành cho sốt rét. Năm 1890, cùng với bác sĩ tâm thần Arthur Leppmann, Ehrlich báo cáo rằng xanh methylen làm giảm đau trong các tình trạng đau dây thần kinh và bệnh thấp ở cơ, khớp và gân. Hai người thảo luận liệu thuốc có thể tác động lên bệnh tâm thần hay không và quyết định không thử. Tuy vậy, một bác sĩ người Ý, Pietro Bodoni ở Genoa, vẫn tiến hành. Bài báo năm 1899 của ông có tiêu đề nói về tác dụng an thần trong nhiều dạng loạn thần: ông mô tả sự dịu lại ở mười bốn bệnh nhân kích động, và ghi nhận rằng các bác sĩ khác ở Genoa đã dùng thuốc nhuộm này với cùng mục đích. An thần không phải là tác động lên bệnh, và sự phân biệt ấy liên tục xuất hiện trong lịch sử này.

Công trình về sốt rét được tiến hành năm 1891, cùng nhà bệnh lý học Paul Guttmann, tại bệnh viện Moabit ở Berlin. Xanh methylen được dùng cho hai bệnh nhân, và báo cáo xuất hiện trên Berliner klinische Wochenschrift ngày 28 tháng 9 năm 1891. Ở ca đầu tiên, bệnh nhân uống một lần 0.5 g thuốc nhuộm vào tối ngày 29 tháng 6; cơn sốt được dự đoán đã không xuất hiện đầy đủ, và triệu chứng khó chịu duy nhất được ghi nhận sau đó là tiểu khó đau nhẹ kèm nước tiểu màu xanh. Các cơn sốt biến mất trong những ngày đầu, và muộn nhất đến ngày thứ tám thì không còn ký sinh trùng trong máu. Chính các tác giả tổng kết rằng những kỳ vọng của họ đã được đáp ứng hoàn toàn. Hai ca không có đối chứng không đủ để chứng minh. Phần trình bày đầy đủ hơn về xanh methylen và sốt rét, bao gồm các thử nghiệm hiện đại, nằm ở một trang riêng; câu hỏi đáng chú ý ở đây hẹp hơn: bao nhiêu phần trong lập luận của Ehrlich còn đứng vững khi đối chiếu với ký sinh trùng.

Lập luận đúng ở đâu và sai ở đâu

Không nhiều phần của cơ chế còn đứng vững, ít nhất không dưới dạng Ehrlich đề xuất. Cách giải thích gọn gàng, theo đó một cation ba vòng phẳng chen vào giữa các cặp base của DNA ký sinh trùng, không đứng vững đối với Plasmodium. Xanh methylen bị hồng cầu nhiễm ký sinh trùng khử dễ dàng đến mức nó hoàn toàn không đến được ký sinh trùng dưới dạng cation phẳng, và cách giải thích bằng sự xen kẽ phù hợp với các thuốc nhuộm acridin lại không phù hợp với chất này.

Những gì bằng chứng thực sự ủng hộ phức tạp hơn. Xanh methylen ức chế glutathione reductase của ký sinh trùng ở các nồng độ có thể đạt được trong cơ thể bệnh nhân. Nó ngăn quá trình chuyển haem thành haemozoin, sắc tố trơ mà ký sinh trùng tạo ra để tránh bị đầu độc bởi chính quá trình tiêu hóa hemoglobin của nó, với mức độ gần tương đương chloroquin và mạnh hơn nhiều so với quinin. Chu trình oxy hóa-khử của nó cũng tạo ra các dạng oxy phản ứng trong một tế bào vốn đã đang tạo ra chúng. Cơ chế nào trong số này là cơ chế thực sự, hay liệu tất cả đều góp phần, vẫn chưa được xác định.

Còn một yếu tố phức tạp nữa, và điều này cần định hướng cách đọc mọi nhận định lịch sử về hợp chất này. Xanh methylen thương mại thời đó không phải là một chất duy nhất. Các mẫu chứa azure B, chất đồng loại đã bị loại một nhóm methyl, và các dung dịch để lâu tích tụ nhiều chất này hơn. Azure B là một thuốc nhuộm dị sắc có các đích khác: nó nhuộm DNA mạch kép thành xanh đậm và RNA thành xanh lục. Một hỗn hợp gồm hai thuốc nhuộm có đích đến khác nhau, với tỷ lệ không được ai ghi lại, không thể làm cơ sở cho một nhận định rõ ràng về tác động của xanh methylen trong đó.

Bản thân thuốc nhuộm chưa bao giờ thay thế được quinin. Phương pháp thì tiến xa hơn. Học trò của Ehrlich là Wilhelm Roehl, làm việc cho tập đoàn thuốc nhuộm và dược phẩm IG Farben, tiếp tục thúc đẩy việc dùng các dẫn xuất thuốc nhuộm làm thuốc cho bệnh nhiệt đới và cung cấp công cụ còn thiếu: chim hoàng yến bị nhiễm sốt rét ở chim, dùng để sàng lọc thường quy các hợp chất ứng viên. Sau đó Werner Schulemann thay đổi chuỗi bên, và muối phenothiazinium thu được đã chữa khỏi tình trạng nhiễm trong thí nghiệm. Nó vẫn khiến bệnh nhân chuyển màu xanh.

Kết quả bền vững hóa ra không phải thuốc nhuộm hay hệ vòng, mà là chuỗi bên. Việc thêm một nhóm dialkylaminoalkylamino làm thay đổi cách phân tử hoạt động, và mảnh cấu trúc này được giữ lại qua mọi lần thiết kế lại về sau. Giữ nhóm đó và thay vòng phenothiazinium bằng một vòng acridin thì thu được quinacrin. Thay bằng một vòng quinolin thì thu được chloroquin. Pamaquin, primaquin và amodiaquin, tất cả vẫn nằm trong danh mục thuốc chống sốt rét, đều mang cùng nhóm này. Hợp chất thất bại trong vai trò điều trị đã cung cấp phần cấu trúc dẫn đến thành công.

Mối liên hệ với các thuốc chống loạn thần đi qua hệ vòng chứ không phải qua loại thuốc đó. Việc làm sáng tỏ cấu trúc xanh methylen đã dẫn Heinrich August Bernthsen đến nhân phenothiazin gốc vào năm 1883; chính bộ khung ấy, với những nhóm thế khác nhau, là đối tượng các nhà hóa học ở Rhône-Poulenc nghiên cứu trong thập niên 1940 khi tìm kiếm thuốc kháng histamin. Một trong những hợp chất đó được tổng hợp vào khoảng cuối năm 1950 và được bác sĩ phẫu thuật Henri Laborit thử nghiệm; ông nhận thấy nó khiến bệnh nhân bình thản và thờ ơ. Lần sử dụng đầu tiên trong tâm thần học được công bố, trên một bệnh nhân hưng cảm, diễn ra vào tháng 1 năm 1952. Thuốc chống loạn thần đầu tiên không hẳn là hậu duệ của thuốc chống sốt rét của Ehrlich, mà giống một họ hàng xa của thuốc nhuộm ông bắt đầu nghiên cứu hơn.

Ba thói quen đáng giữ lại từ câu chuyện này

1. "Thuốc tổng hợp đầu tiên được dùng trong y học" mô tả một phạm trù, và những điều kiện đi kèm nhiều hơn cụm từ ấy gợi ra. Cụm từ này đã trở nên quen thuộc; một bài tổng quan được trích dẫn nhiều của Schirmer và cộng sự trên Neurobiology of Aging gọi xanh methylen là thuốc hoàn toàn tổng hợp đầu tiên được dùng trong y học. Chloral hydrat đã được đưa vào sử dụng làm thuốc an thần tổng hợp năm 1869, sớm hơn hơn hai mươi năm. Chính bài báo năm 1891 cung cấp một phần câu trả lời, vì các tác giả nêu tên những thuốc hạ sốt tổng hợp đã thất bại trước sốt rét, trong đó có quinolin, antipyrin và antifebrin. Thuốc chứa arsen của chính Ehrlich dành cho giang mai còn xuất hiện muộn hơn nữa. Phiên bản có thể bảo vệ được của nhận định này nói về phương pháp hơn là vị trí đầu tiên: xanh methylen nằm trong số những hợp chất tổng hợp sớm nhất được chọn để tác động lên một sinh vật cụ thể dựa trên một lý thuyết hóa học về tính chọn lọc.
2. Phân bố chọn lọc không đồng nghĩa với lợi ích chọn lọc. Kết quả năm 1886 của Ehrlich là thuốc nhuộm đi đến mô thần kinh. Một hợp chất đi đâu và làm gì khi đến đó là hai phép đo khác nhau, và phép đo thứ nhất dễ thực hiện hơn nhiều. Kể từ đó, phần lớn các nhận định về xanh methylen và não bộ nằm trong khoảng cách ấy.
3. Độ tinh khiết thuộc về bằng chứng, không phải tiếp thị. Hồ sơ lịch sử không rõ ràng chính vì lý do này. Những khác biệt nhỏ về cấu trúc làm thay đổi nơi hợp chất này đi đến, vì vậy phiếu kết quả phân tích phải gắn với một lô cụ thể thay vì được đưa ra như một tuyên bố chung rằng sản phẩm đã được kiểm nghiệm. Một bên bán tuyên bố phù hợp với chuyên luận dược điển nhưng chỉ kiểm nghiệm kim loại nặng đang khẳng định nhiều hơn những gì báo cáo chứng minh. Blupreme lấy xanh methylen từ một nhà sản xuất dược phẩm và kiểm nghiệm toàn bộ các chỉ tiêu mà chuyên luận quy định: định tính, độ tinh khiết, tạp chất hữu cơ, dung môi tồn dư, tạp chất nguyên tố, cắn sau nung, giới hạn vi sinh vật và nội độc tố vi khuẩn. Báo cáo được công bố cùng sản phẩm, và trang xanh methylen đạt chuẩn USP giải thích những giới hạn đó cũng như vì sao kết quả azure B là mục đầu tiên cần xem.

Dấu vết nguồn tư liệu theo thời gian

Chuỗi các cột mốc theo thời gian, bao gồm hóa học thuốc nhuộm trước Ehrlich và các cấp chất lượng cùng tiêu chuẩn kỹ thuật sau ông, được trình bày riêng trong lịch sử xanh methylen, còn bản chất của chính hợp chất được giải thích trong bài xanh methylen là gì.

Các bản hình tư liệu làm nền cho bài viết này, được in lại trong bài tổng quan năm 2012 của Krafts, Hempelmann và Skórska-Stania, không có giá trị tương đương nhau, và một ví dụ cho thấy vì sao. Bản hình năm 1891 là hồ sơ gốc của thử nghiệm; bức chân dung năm 1910 bên cạnh nó chỉ xác định thời điểm của một danh tiếng, không hơn. Những trang trong sổ tay năm 1934 của Andersag là dấu vết trực tiếp của việc thay thế bằng vòng quinolin, do chính tay nhà hóa học ghi lại.

Tóm tắt trung thực về các thí nghiệm thuốc nhuộm của Ehrlich là ông đã xác định đúng tính chọn lọc và đúng đích, nhưng sai về cơ chế. Xanh methylen thực sự tập trung trong mô thần kinh và thực sự gây hại cho ký sinh trùng sốt rét. Nó không làm được điều thứ hai vì điều thứ nhất, và lý do hóa học ông đưa ra cho cả hai đều sai. Điều ông chứng minh không thể phủ nhận có giá trị lâu dài hơn một cơ chế đúng: một hợp chất có thể được chủ động lựa chọn thay vì tình cờ tìm thấy, và được lựa chọn dựa trên bằng chứng thu thập trước khi bất kỳ ai dùng nó cho bệnh nhân.