Nhuộm xanh methylene: các phương pháp hiển vi và bộ ảnh thực tế

Nhuộm xanh methylene giúp dễ phân biệt những đặc điểm tế bào vốn khó thấy khi quan sát bằng kính hiển vi trường sáng. Phương pháp này có thể giúp học sinh tìm nhân tế bào niêm mạc má hoặc quan sát đường viền và cách sắp xếp của vi sinh vật. Tuy nhiên, một vật thể màu xanh chỉ là một quan sát. Xác định tên sinh vật, đo kích thước và quyết định xem nó có chỉ dấu bệnh hay không là những công việc riêng biệt.

Ảnh bìa minh họa nguyên lý tương phản. Bộ ảnh bên dưới gồm những ảnh chụp thực từ các mẫu vật được ghi nhận độc lập, kèm thông tin nguồn gốc ban đầu.

Xanh methylene làm nổi bật những gì?

Xanh methylene là thuốc nhuộm bazơ: ion mang màu của nó mang điện tích dương. Như OpenStax giải thích trong phần về nhuộm mẫu vật, thuốc nhuộm bazơ tương tác với vật chất tế bào mang điện tích âm và có thể làm tế bào nổi bật trên nền sáng hơn. Trong các tiêu bản phù hợp, xanh methylene làm nổi bật những vùng giàu axit nucleic và các cấu trúc khác có khả năng gắn thuốc nhuộm.

Trong phương pháp nhuộm đơn, một thuốc nhuộm tạo ra độ tương phản. Vì vậy, nhiều sinh vật có thể cùng hiện màu xanh mà không phải là cùng một loại sinh vật. Ban đầu, những câu hỏi hữu ích mang tính mô tả: các vật thể tròn hay thuôn dài, nằm riêng lẻ hay thành cụm, nhuộm màu đồng đều hay có sự khác biệt bên trong? Hãy xem sự khác biệt giữa nhuộm đơn và nhuộm Gram trước khi diễn giải màu sắc như một kết quả phân loại.

Độ tương phản và độ phân giải là hai khái niệm khác nhau. Độ tương phản giúp phân biệt một vật thể với môi trường xung quanh; độ phân giải giúp phân biệt các chi tiết nằm gần nhau. Ảnh đậm màu hơn không bảo đảm sẽ phân biệt được nhiều cấu trúc hơn. Cũng không phải mọi hạt sẫm màu đều nên được gọi là bào quan.

Tiêu bản tươi không nhuộm, tiêu bản ướt có nhuộm và tiêu bản phết

Tiêu bản ướt không nhuộm, hay tiêu bản tươi, cho phép quan sát mà không thêm thuốc nhuộm, dù việc lấy mẫu ra khỏi môi trường ban đầu vẫn làm thay đổi mẫu vật. Tiêu bản ướt có nhuộm được bổ sung thuốc thử trong khi vật liệu vẫn nằm trong chất lỏng dưới lamen. Với tiêu bản phết cố định, vật liệu được dàn trên lam kính và xử lý bằng một phương pháp cố định xác định trước các bước xử lý tiếp theo. Phần tổng quan về chuẩn bị tiêu bản của OpenStax phân biệt tiêu bản ướt với việc cố định và giải thích vì sao sinh vật đã cố định không còn cho phép quan sát chuyển động hoặc hoạt động chuyển hóa bình thường.

Các loại tiêu bản này trả lời những câu hỏi khác nhau:

Để so sánh trong lớp học, hãy ghi lại một tiêu bản không nhuộm trước khi quan sát một tiêu bản có nhuộm được chuẩn bị riêng theo quy trình giảng dạy. Giữ điều kiện chiếu sáng và cài đặt chụp ảnh tương đương. Nếu chụp hai tế bào khác nhau, hãy mô tả chúng là các ví dụ, không phải bản ghi trước và sau của cùng một tế bào.

Bộ ảnh hiển vi: ba mẫu vật đã nhuộm thực tế

Bộ ảnh này là phần tuyển chọn và diễn giải riêng về ba ảnh hiển vi được cấp phép mở. Các tác giả nguồn xác định mẫu vật và thuốc nhuộm. Chúng tôi chưa xác thực độc lập các mẫu vật của họ. Ảnh được tái bản nguyên khung dưới dạng chuyển đổi WebP không mất dữ liệu, không thêm chi tiết hoặc thay đổi màu sắc.

Ảnh 1: tế bào niêm mạc má người

Mẫu vật: tế bào niêm mạc má người. Thuốc nhuộm: xanh methylene. Độ phóng đại: 400×, theo thông tin của người chụp. Thước tỷ lệ: không có; nguồn không cung cấp kích thước điểm ảnh đã hiệu chuẩn. Ảnh của Fritzmann2002, 2017, từ Tế bào niêm mạc má người (nhuộm xanh methylene), theo giấy phép CC BY-SA 4.0. Bản tái bản này giữ nguyên giấy phép đó.

Hãy bắt đầu với một tế bào nằm riêng lẻ: nhân sẫm màu hơn của nó dễ phân biệt với phần tế bào chất màu xanh xung quanh. Sau đó quan sát các tế bào chồng lên nhau phía dưới. Sự chồng lấp khiến ranh giới khó lần theo hơn và có thể tạo ra một vùng đậm màu cục bộ. Dùng ảnh này để luyện lần theo đường viền, không phải để coi mọi mảng sẫm màu là một nhân. Hướng dẫn quan sát tế bào niêm mạc má trình bày chi tiết bài thực hành dành riêng cho loại mẫu này.

Ảnh 2: tế bào hành

Mẫu vật: tế bào hành, theo xác định của nguồn. Thuốc nhuộm: xanh methylene. Độ phóng đại: “200x” xuất hiện trong tên tệp gốc; thông tin này chưa được xác nhận độc lập. Thước tỷ lệ: không có; không có dữ liệu hiệu chuẩn. Ảnh của Alvy16, 2019, từ Tế bào hành 200x, theo giấy phép CC BY 4.0.

Các khoang thuôn dài tạo thành một lớp có tổ chức. Hãy so sánh những ranh giới chung dài của chúng với các đường viền không đều trong Ảnh 1. Đồng thời chú ý đến vật chất sẫm màu nổi bật và độ sáng không đều của trường quan sát. Bức ảnh không xác định được bản chất của mọi phần lắng đọng sẫm màu. Nó cho thấy vì sao một bản ghi quan sát hữu ích cần bao gồm cả giả ảnh và những điều chưa chắc chắn, thay vì gán nhãn cho mọi thứ bắt màu.

Ảnh 3: nấm men được nguồn xác định là Candida spp.

Mẫu vật: Candida spp., theo người chụp. Thuốc nhuộm: nhuộm dương tính đơn bằng xanh methylene. Độ phóng đại: không có thông tin. Thước tỷ lệ: không có; không cung cấp kích thước điểm ảnh đã hiệu chuẩn. Ảnh của Marta, người dùng Wikimedia Martunia.g, 2021, từ Nhuộm dương tính bằng xanh methylene 2, theo giấy phép CC BY 4.0.

Hãy so sánh các cụm màu xanh dày đặc với vùng rìa thưa hơn. Đường viền của từng vật thể dễ lần theo hơn ở nơi chúng ít chồng lấp. Tên Candida được lấy từ hồ sơ nguồn, không phải từ việc định danh loài trên bức ảnh này. Ảnh này cũng không cung cấp kết quả về khả năng sống. Các phép thử khả năng sống và hô hấp của nấm men cần có điều kiện, đối chứng và cách diễn giải riêng.

Đọc tỷ lệ đúng cách

Các ảnh này hỗ trợ so sánh trực quan, không hỗ trợ đo theo micromet hoặc so sánh kích thước tuyệt đối của tế bào giữa các ảnh. Độ phóng đại được ghi nhận không thể bù cho dữ liệu hiệu chuẩn máy ảnh còn thiếu. Thay đổi kích thước hiển thị của ảnh sẽ thay đổi độ phóng lớn cảm nhận được.

Đối với ảnh của bạn, hãy thiết lập hiệu chuẩn phép đo bằng một chuẩn đã biết và cấu hình quang học tương ứng. Hướng dẫn đo vi mô của Nikon giải thích cách thước trắc vi vật kính chuyển các vạch chia tùy ý trên ảnh hoặc thước thị kính thành độ dài vật lý. Ghi lại vật kính, cấu hình máy ảnh và dữ liệu hiệu chuẩn, rồi thêm thước tỷ lệ dựa trên các dữ liệu đó. Không suy ra thước tỷ lệ từ kích thước tế bào trung bình trong sách giáo khoa.

Chai thuốc thử có phù hợp với phương pháp không?

Một chai có nhãn xanh methylene không phải là bộ thông số kỹ thuật đầy đủ cho phòng thí nghiệm. Hãy kiểm tra nồng độ và đơn vị, dung môi, các thành phần bổ sung, ứng dụng dự kiến, tài liệu theo lô và hướng dẫn. Phiếu dữ liệu an toàn của thuốc thử mô tả các mối nguy; hướng dẫn phương pháp xác định cách sử dụng thuốc thử cho loại tiêu bản dự kiến.

Một ví dụ cụ thể là dung dịch xanh methylene Löffler của Merck. Nhà sản xuất xác định đây là thuốc thử dùng cho kính hiển vi và mô tả vai trò của nó là thuốc nhuộm đối màu trong phương pháp nhuộm kháng axit. Tính dễ cháy được liệt kê cũng cho thấy vì sao thông tin “một chất lỏng màu xanh” là chưa đủ để lên kế hoạch thao tác hoặc gia nhiệt. Những đặc tính đó áp dụng cho công thức này, không tự động áp dụng cho mọi dung dịch xanh methylene trong nước.

Tương tự, thạch eosin xanh methylene là một môi trường nuôi cấy có công thức phối chế. Nó không phải là thuốc nhuộm tiêu bản được tạo ra bằng cách thêm riêng xanh methylene vào mẫu vật. Với mục tiêu tạo ảnh khác, hãy so sánh các lựa chọn thay thế xanh methylene trong hiển vi.

Với bộ kính hiển vi dành cho người mới bắt đầu, hãy bắt đầu bằng phương pháp giáo dục được ghi trong tài liệu của bộ, các tiêu bản làm sẵn đã biết rõ và thuốc thử được chỉ định. Nếu chai mất nhãn hoặc không thể xác định thành phần, hãy thay bằng thuốc thử phù hợp có đầy đủ tài liệu. Sử dụng phương tiện bảo vệ mắt và tuân theo hướng dẫn thao tác dành cho đúng công thức đang dùng. Vật liệu từ người và mẫu môi trường chưa rõ nguồn gốc cần được xử lý và thải bỏ theo quy trình của phòng thí nghiệm giảng dạy; nhuộm không thay thế được các quy trình đó.

Ghi lại quan sát trước khi đưa ra kết luận

“Các vật thể màu xanh hình bầu dục tụ thành cụm” là một mô tả hình ảnh có cơ sở. “Một tình trạng nhiễm trùng cụ thể” cần những bằng chứng mà hình ảnh chưa cung cấp. Hãy ghi riêng nguồn gốc mẫu vật, cách chuẩn bị, phản ứng nhuộm và phương pháp định danh trong sổ ghi chép. Sự phân biệt đó giúp một ảnh đơn giản trong lớp học trở nên hữu ích và tránh gán cho một ảnh hiển vi đẹp mắt những khẳng định mà nó không thể chứng minh.