Metilen ko‘ki va mitoxondriyalar: elektron tashilishi va dalillar

Yonma-yon turgan ikkita preparatni tasavvur qiling. Ikkalasida ham nafas olish zanjirining I kompleksini to‘sadigan rotenon kimyoviy moddasi bilan zaharlangan miya mitoxondriyalari bor. Tajribachi ulardan biriga pipetka bilan metilen ko‘kining mikromolyar dozasini qo‘shadi. Kislorod sarfi qisman tiklanadi. Membrana kuchlanishi qisman qaytadi. Oz miqdorda ATP sintezi qayta boshlanadi. Yonidagi kyuvetada peroksid sensori voqeaning ikkinchi yarmini ko‘rsatadi: sinovdan o‘tkazilgan har bir dozada, tekshirilgan har bir substrat sharoitida vodorod peroksid hosil bo‘lishi bir necha baravar ko‘paygan.

Ikkala ko‘rsatkich ham to‘g‘ri. Metilen ko‘ki nafas olish zanjirining shikastlangan qismini chetlab, elektronlar oqimini davom ettira oladigan tashuvchidir; ayni shu tashuvchi bu ishni bajarayotganda peroksid ko‘payishi bilan haq undiradi. Ikkala faktni birga hisobga olsangiz, metilen ko‘kining mitoxondriyalardagi faoliyati haqidagi adabiyot tushunarli bo‘ladi. Faqat bittasini hisobga olsangiz, birinchi bo‘lib qaysi maqolani ochganingizga qarab, u mo‘jiza yoki tahdid bo‘lib ko‘rinadi.

Elektron tashuvchining sodda izohi

Nafas olish zanjiri — uzatishlar ketma-ketligi. Elektronlar I kompleksga (NADH dan) yoki II kompleks va unga aloqador flavin fermentlariga (suksinat va shunga o‘xshash donorlardan) kiradi, III kompleks orqali harakatchan tashuvchi sitoxrom c ga, so‘ng IV kompleks orqali kislorodga o‘tadi. Har bir uzatishda protonlar ichki membrana orqali haydaladi va hosil bo‘lgan gradiyent ATP sintezini harakatga keltiradi. Biror bo‘g‘inni to‘sib qo‘ysangiz, undan oldingi zanjir qismi jimib qoladi.

Metilen ko‘ki bu jarayonga parallel tashuvchi sifatida qo‘shiladi. Uning oksidlangan shakli zanjirning oldingi qismidagi tashuvchilardan elektronlarni olib, rangsiz qaytarilgan shakl — leykometilen ko‘kiga aylanadi. Bu shakl esa elektronlarni zanjirning keyingi qismiga uzatib, yana ko‘k rangga qaytadi. Ikki shakl oksidlanish-qaytarilish juftligi haqidagi izohda tasvirlangan, elektronlarni uzatishning kengroq xususiyatlari esa umumiy mexanizm izohida yoritilgan. Ochiq qolayotgan savol — tashuvchi zanjirga qayerdan qayta qo‘shiladi: III kompleksning Qo markazi deb ataladigan xinol bog‘lanish cho‘ntagidanmi yoki bevosita sitoxrom c danmi? Qaysi chiqish yo‘li ustun bo‘lishi sharoitga bog‘liq; bu III kompleksni chetlab o‘tish tahlilida batafsil bayon qilingan.

Kemiruvchilardagi uch tadqiqot aslida nimani o‘lchagan

Uchala tadqiqotda ham ajratilgan miya mitoxondriyalari, ya’ni hujayradan chiqarilib, tarkibi belgilangan buferda suspenziya holiga keltirilgan organellalar ishlatilgan. Butun hujayralar ham, modda berilgan hayvonlar ham, inson ishtirokchilar ham bo‘lmagan. Konsentratsiyalar inson og‘iz orqali qabul qiladigan dozaga emas, organellalarni o‘rab turgan eritmaga tegishli. Shu doirani yodda tutsangiz, raqamlar aniq ma’no beradi.

Ajratilgan dengiz cho‘chqasi miya mitoxondriyalarida 100 nanomolyardan 2 mikromolyargacha bo‘lgan konsentratsiyalarda o‘tkazilgan birinchi tadqiqot bitta preparatda foyda va salbiy jihatlarni aniqladi. Sog‘lom mitoxondriyalarda bo‘yoq tinch holatdagi kislorod sarfini oshirdi, ammo ADP rag‘batlantirgan nafas olishni o‘zgartirmadi, shuning uchun nafas olish bilan bog‘langan ATP ishlab chiqarilishi yaxshilanmadi. I kompleks to‘silganda, 2 mikromolyar konsentratsiya ATP sintezini daqiqasiga har milligramm uchun 46 dan 93 nanomolgacha tikladi; normal tezlik esa taxminan 1109 edi. III kompleks to‘silganda, xuddi shu doza ATP sintezini taxminan 46 dan 63 gacha tikladi; normal tezlik taxminan 910 edi. Kuchlanish va kalsiyning yutilishi qisman tiklandi. IV kompleksning sianid bilan to‘silishini chetlab o‘tib bo‘lmadi, demak, elektronlarning foydali chiqish nuqtasi ishlayotgan IV kompleksdan oldin joylashgan. Har bir tiklanish statistik jihatdan haqiqiy, ammo kichik edi: normal ATP ishlab chiqarilishining bir xonali foizlariga teng.

Sichqon bosh miya po‘stlog‘i mitoxondriyalarida taxminan 1 mikromolyar konsentratsiyada o‘tkazilgan ikkinchi tadqiqot I kompleksni chetlab o‘tishni tasdiqladi va III kompleksda chegara borligini ko‘rsatdi. Rotenon nafas olishni daqiqasiga har milligramm uchun taxminan 121 nanomol kisloroddan 2 nanomoldan ham kam darajaga tushirdi, bo‘yoq esa uni taxminan 21 gacha, ya’ni normal darajaning qariyb oltidan birigacha ko‘tardi; bunda membrana kuchlanishi deyarli to‘liq tiklandi. Ammo III kompleks to‘silgach, 1 dan 5 mikromolyargacha bo‘lgan konsentratsiyalarda na nafas olish, na kuchlanish tiklandi; to‘siq bo‘yoq keltirib chiqargan peroksid signalini ham susaytirdi. Mualliflar qaytarilgan bo‘yoq elektronlarini III kompleksning Qo markaziga yetkazadi, degan taxminni ilgari surdilar: bu markaz band bo‘lsa, tashuvchi elektronlarni yetkazadigan joy topa olmaydi.

Asosan 2 mikromolyar konsentratsiyada sichqon, kalamush va dengiz cho‘chqasi miya mitoxondriyalarida o‘tkazilgan uchinchi tadqiqot ziddiyatni bevosita tekshirdi va III kompleksdagi to‘siqni chetlab o‘tish mumkinligini aniqladi. Qo markazi ingibitori miksotiazol bazal nafas olishni 88 foizga kamaytirganida, bo‘yoq kislorod sarfini to‘siqsiz tezlikning taxminan 62 foizigacha tikladi. Bevosita sinovda yarim mikromolyar konsentratsiya hatto III kompleks to‘silganida ham ekzogen sitoxrom c ni qaytardi. Bu NADH dan bo‘yoq orqali sitoxrom c ga, undan esa IV kompleksga boradigan yo‘lni qo‘llab-quvvatlaydi. Ammo tiklangan nafas olish noodatiy kechdi: qo‘shilgan ADP kislorod sarfini oshirish o‘rniga kamaytirdi, ATP sintezini to‘sish esa nafas olishni rag‘batlantirdi. Kuchlanish faqat qisman repolyarizatsiyalandi. Teskari bog‘lanish bilan birga kuzatiladigan yuqori kislorod sarfi normal energiya ishlab chiqarish emas.

Nega laboratoriyalar xulosalari farq qiladi va buni nima oydinlashtiradi

Avvalo, farqni hayvon turlari bilan izohlash o‘zini oqlamaydi. Uchinchi guruh ishni uch xil kemiruvchida takrorladi va ularning barchasida, jumladan, chetlab o‘tish yo‘li yo‘q deb xabar qilingan sichqon liniyasida ham, sifat jihatidan bir xil chetlab o‘tishni kuzatdi. Asl farqlar konsentratsiyada (1 va 2 mikromolyar), ingibitor dozalarida, buferlarda, ajratish usullarida va, eng avvalo, taqqoslanayotgan energetik holatda: chetlab o‘tish ADP qo‘shilishidan oldin eng yaqqol ko‘rinadi, aynan shu paytda ADP ga paradoksal javob paydo bo‘ladi. Shu sababli dalillarga mos diagramma sharoitga bog‘liq ikkita chiqish yo‘lini ko‘rsatadi: biri Qo markazida, ikkinchisi sitoxrom c da. Tashuvchi elektronlarni mahalliy kimyoviy sharoit imkon bergan joyga yetkazadi.

Peroksid evaziga to‘lanadigan haq

Salbiy jihatlar ham faoliyat tiklanishi kabi izchil kuzatiladi. Dengiz cho‘chqasi bilan o‘tkazilgan ishda bo‘yoq barcha uch substratda, tekshirilgan har bir holatda — tinch holatda, ATP sintezi vaqtida va kimyoviy shikastlangan sharoitda — peroksid ajralishini oshirdi. ATP sintezi davomida 1 mikromolyar konsentratsiyada peroksid hosil bo‘lishi daqiqasiga har milligramm uchun taxminan 148 dan 1500 pikomoldan ham yuqoriga ko‘tarildi; hatto 100 nanomolyar konsentratsiya ham signalni to‘rt baravardan ko‘proq oshirdi. Bo‘yoq peroksidning yo‘qotilishini ham taxminan 2.6 baravar sekinlashtirdi, shuning uchun signal ham tezroq hosil bo‘lishni, ham sekinroq yo‘qotilishni aks ettiradi. Taxmin qilingan kimyoviy jarayon — aniqlanadigan superoksid hosil bo‘lmasdan, qaytarilgan bo‘yoqning kislorodni bevosita qaytarishi; ammo bu hali isbotlangan bosqich emas, balki talqin bo‘lib qolmoqda.

Sichqonlar bilan o‘tkazilgan ish manzarani foydali tarzda murakkablashtiradi. Peroksid doza bilan keskin oshdi: 2 mikromolyar konsentratsiyada boshlang‘ich taxminan 76 darajadan daqiqasiga har milligramm uchun qariyb 2000 pikomolgacha yetdi, ammo III kompleksning to‘silishi bo‘yoq keltirib chiqargan qismini susaytirdi. Agar peroksid faqat qaytarilgan bo‘yoqning kislorod bilan reaksiyasidan hosil bo‘lganida, zanjirni to‘sish bunchalik ahamiyatli bo‘lmas edi. Ammo u ahamiyatli, demak, zanjir ham ishtirok etadi. Antioksidant va prooksidant xususiyatlar sharhi bu ikki tomonlama xususiyatni kengroq kontekstga joylashtiradi, kislorod va ATP tahlili esa nega faqat kislorod ko‘rsatkichlari energiya haqidagi da’voni hech qachon hal qila olmasligini tushuntiradi.

Faoliyatni tiklash tuzatish emas

Qo‘llashdan voz kechish kerak bo‘lgan ibora — «metilen ko‘ki mitoxondriyalarni tuzatadimi». Tuzatish barqaror o‘zgarishni anglatardi: komplekslarning qayta tiklanishi, modda chiqarilgandan keyin ham saqlanadigan bog‘lanish, butun hujayralarda faoliyatning tiklanishi, keyin esa tirik organizmda funksiyaning yaxshilanishi. Uch maqolaning hech biri buni ko‘rsatmaydi. Ular sun’iy kimyoviy to‘siq paytida yangi ajratilgan organellalarda elektronlar yo‘lining tezkor o‘zgarishini ko‘rsatadi; bunda ATP ishlab chiqarilishi normal darajaning kichik ulushlariga teng, bog‘lanish esa ba’zan ochiqchasiga g‘ayrioddiy. Rotenon va antimitsin — laboratoriya vositalari, qarish yoki insondagi mitoxondrial kasallik modellari emas. Bu natijalarning hech biri sog‘lom odamda ko‘proq energiya bo‘lishini anglatmaydi; bu insonlar ishtirokidagi o‘z adabiyotiga ega alohida dalillar masalasidir.

Biohakingga oid har qanday xulosani haqqoniy saqlash uchun uchta chegarani hisobga olish kerak. Birinchidan, eritma konsentratsiyasi doza emas: ajratilgan organellalar atrofidagi 0.1 dan 2 mikromolyargacha konsentratsiya og‘iz orqali qabul qilinadigan qaysi miqdor inson miyasi mitoxondriyasi yonida shunday erkin konsentratsiyani hosil qilishi haqida hech narsa demaydi, ayniqsa bo‘yoqning to‘planishi yoki ajralishi membrana kuchlanishining o‘ziga bog‘liq bo‘lgani uchun. Ikkinchidan, kislorod energiya emas: bo‘yoq kislorod sarfini samarali fosforlanish orqali ham, siklik aylanish va elektronlar sizib chiqishi orqali ham oshirishi mumkin. Shuning uchun ATP va kuchlanish ko‘rsatkichlarisiz respirometriya energiya haqidagi da’voga asos bo‘la olmaydi. Uchinchidan, foyda va yuk bir gapda tilga olinishi kerak: kuchlanish yoki ATP tiklangani haqidagi har qanday bayonot bir vaqtda yuz bergan peroksid oshishini tashlab ketsa, tajribani noto‘g‘ri yoritadi. Tegishli qo‘shimcha shartlar qatoriga NAD ning oksidlanish-qaytarilish muvozanati, doza–javob bog‘liqligining shakli va tahlil usullarini tanlash qo‘llanmasi kiradi.

Bitta amaliy izoh: elektron tashish aynan shu molekulaning xususiyatidir. Azure B kabi demetillangan o‘xshash moddalar ham oksidlanish-qaytarilish jarayonlarida faol, ammo o‘zini boshqacha tutadi. Shu bois qisman parchalanib ketgan eritma bilan tajriba o‘zgarmagan bo‘yoq bilan tajribadan farq qiladi. Faqat metallarni tekshirish bilan cheklanmay, to‘liq farmakopeya spetsifikatsiyasi va e’lon qilingan partiya hujjatini talab qilishning sabablaridan biri shu. Yorug‘lik ta’siridagi kimyoviy jarayonlar yoritilgan sharoitda qo‘llash uchun yana bir ehtiyot shartini qo‘shadi; bu qizil yorug‘lik bilan birgalikda qo‘llash mavzusida yoritilgan.

Tor doiradagi da’vo bularning barchasidan keyin ham o‘z kuchini saqlaydi va uni saqlab qolishga arziydi: metilen ko‘ki shikastlangan, ajratilgan mitoxondriyalarda sharoitga bog‘liq elektron tashuvchi bo‘lib, peroksid ko‘payishi evaziga oqimni qisman saqlashi mumkin. Bundan tashqaridagi hamma narsa — energiya, uzoq umr, tuzatish — bu tadqiqotlar taqdim etish uchun hech qachon mo‘ljallanmagan dalillarni kutmoqda.