Стаття
Фотодинамічна терапія з метиленовим синім: як досліджують лікування
Фотодинамічна терапія з метиленовим синім здається процедурою з двох кроків: нанести синій барвник і спрямувати на нього червоне світло. Таке уявлення хибне, і саме воно спричиняє більшість непорозумінь щодо цього лікування. Досліджувана процедура має три складники, які повинні одночасно бути в одному місці: фотосенсибілізатор у формі, що поглинає світло, фотони відповідної довжини хвилі у виміряній дозі та молекулярний кисень, який приймає передану енергію. Якщо прибрати будь-який із цих складників, заявлений ефект не матиме механізму реалізації.
Ця стаття пояснює, як дослідники описують цю систему з трьох складників, які параметри контролюють і чому опубліковані значення довжини хвилі та енергії не можна перетворити на домашню процедуру. Результати щодо онкологічних захворювань розглянуто в окремому огляді досліджень метиленового синього та раку, а стоматологічні застосування зібрано в матеріалах про фотодинамічні дослідження ротової порожнини та зубів. Тут ці теми не дублюються.
Барвник — це фотосенсибілізатор, а не засіб для забарвлення
Метиленовий синій сильно поглинає червоне світло: пік поглинання мономера розташований приблизно на 664–666 nm, а молярний коефіцієнт поглинання дуже високий. Саме через цю смугу поглинання в дослідженнях фотодинамічної терапії з метиленовим синім використовують джерела червоного світла, зазвичай у діапазоні приблизно від 630 до 680 nm. Лампа, що випромінює поза цією смугою, може здаватися яскравою, але майже не забезпечувати придатного для реакції збудження. Закономірності вибору довжини хвилі пояснено в матеріалі про те, як метиленовий синій поглинає червоне світло.
Поглинання — лише перший етап. Збуджений барвник переходить у довгоживучіший триплетний стан, із якого можливі два фотохімічні шляхи. У реакціях типу I збуджений барвник обмінюється електронами або атомами водню з навколишніми субстратами й утворює радикали, зокрема з подальшою участю супероксиду. У реакціях типу II барвник у триплетному стані передає енергію безпосередньо кисню в основному стані й утворює синглетний кисень. За наявності кисню метиленовий синій переважно діє як сенсибілізатор утворення синглетного кисню; повідомлений квантовий вихід у воді становить близько 0.5, тоді як внесок реакцій типу I зростає або зменшується залежно від місцевого середовища. Огляд фотохімії метиленового синього з біологічними субстратами 1993 року описує обидва шляхи й показує, чому їхнє співвідношення не можна визначити за етикеткою барвника.
Той самий огляд називає головну мішень серед компонентів нуклеїнових кислот. Гуанін має найнижчий потенціал окиснення серед основ ДНК, тому синглетний кисень переважно окиснює саме його, утворюючи такі продукти, як 8-оксо-дезоксигуанозин. Для такого пошкодження інтеркаляція в ДНК не потрібна. Водночас огляд застерігає від зведення всього механізму до ДНК. Метиленовий синій окиснює білки, ліпіди та мембрани, а мішень, пошкодження якої спричиняє загибель у конкретному експерименті, залежить від локалізації барвника. Тому концентрація в розчині, що оточує зразок, є слабким непрямим показником дози на мішені. Порівнюючи цю світлозалежну хімію з окисно-відновними функціями барвника без освітлення, слід розрізняти ці процеси, як пояснено в матеріалі про те, як метиленовий синій працює в клітинах.
Вихідна сполука для розробки, а не оптимізований препарат
Друге ключове джерело — огляд розробки фенотіазинієвих фотосенсибілізаторів 2005 року, у якому метиленовий синій розглядають як вихідну структуру з відомими недоліками, а не як готовий фотосенсибілізатор. Невеликі структурні зміни впливають на ліпофільність, поглинання клітинами, внутрішньоклітинну локалізацію, вихід синглетного кисню, токсичність без освітлення та стійкість до відновлення. Наприклад, метилювання хромофора підвищує ліпофільність і утворення синглетного кисню та сповільнює відновлення до неактивної лейкоформи; у дослідженні, на якому ґрунтується огляд, метильовані аналоги виявляли вищу фототоксичність за приблизно 7.2 J per square cm. Проте вища ліпофільність не означає автоматично кращих властивостей, оскільки надмірна гідрофобність погіршує розчинність, сприяє агрегації та може порушувати геометрію, потрібну для фотохімічних реакцій.
Питання лейкоформи заслуговує на особливу увагу, адже ця зміна невидима. Окиснений метиленовий синій має синій колір і поглинає червоне світло. Відновлений лейкометиленовий синій майже безбарвний і слабко поглинає в тому самому діапазоні, тому барвник, відновлений усередині клітин або в недостатньо насиченій киснем тканині, тимчасово випадає з фотоактивного пулу до повторного окиснення. Отже, окисно-відновний стан тканини змінює ефективну концентрацію фотосенсибілізатора навіть за незмінної концентрації нанесеного розчину. Історію форм препарату, зокрема ранні клінічні та лабораторні застосування цієї родини барвників, розглянуто в історії метиленового синього в медицині.
Таблиця досліджень: що змінюється і що це означає
Наведена нижче таблиця — оригінальний порівняльний матеріал цієї статті. Кожен рядок описує одну змінну процедури, яку необхідно зазначати в дослідженнях. Читайте рядки зліва направо, щоб зрозуміти, чому зміна одного параметра змінює значення всіх інших.
| Змінна | Що зазначають у дослідженнях | Чому це змінює результат |
|---|---|---|
| Форма фотосенсибілізатора | Вільний барвник у воді, фізіологічному розчині або буфері; середовища на основі етанолу та Cremophor у дослідженнях на тваринах; ліпосоми, полімерні частинки або циклодекстринові носії в експериментальних роботах | Середовище та носій змінюють поглинання, локалізацію та проникнення крізь бар’єри, як-от матрикс біоплівки або пухлинна тканина |
| Концентрація під час застосування | В антимікробних дослідженнях за участю людей повідомляють про приблизно 0.0003–0.06 M з інтервалами від 1 до 5 хвилин між нанесенням препарату та освітленням; у дослідженнях пухлин у тварин є приклади внутрішньопухлинного введення приблизно 500 micrograms per mL | Вища концентрація в загальному об’ємі може посилювати димеризацію з поглинанням поблизу 590 nm і зменшувати продуктивну фотохімію мономера, тому подвоєння концентрації не обов’язково подвоює ефект |
| Інтервал між застосуванням препарату та освітленням | Хвилини в місцевих антимікробних експериментах; довший інтервал, залежний від середовища, у пухлинних моделях | Інтервал визначає, де перебуває барвник у момент надходження світла, а це визначає головну біологічну мішень |
| Довжина хвилі | Зазвичай приблизно від 630 до 680 nm | Має перекриватися зі смугою поглинання мономера; розчини з високим вмістом димерів зміщують ефективне поглинання |
| Опроміненість | В антимікробних дослідженнях за участю людей зазначають приблизно від 50 до 750 mW per square cm; у дослідженнях ран у тварин зазвичай 100 mW per square cm або менше | Висока опроміненість може виснажувати місцеві запаси кисню швидше, ніж перфузія їх відновлює, що знижує ефективність за того самого номінального флюенсу |
| Флюенс | В антимікробних дослідженнях за участю людей зазначають приблизно від 6 до 18 J per square cm за час від 8 секунд до 10 хвилин; у дослідженнях ран у тварин — приблизно від 12 до 360 J per square cm | Загальна енергія без даних про опроміненість, час і геометрію не дає повного опису дози |
| Насичення киснем | Рідко контролюють безпосередньо; оцінюють за типом тканини, швидкістю надходження флюенсу та фракціонуванням | Реакції типу II споживають кисень, тому однакові параметри світла можуть давати різні ефекти в добре перфузованих і гіпоксичних мішенях |
| Мішень та умови | Моделі інфекцій шкіри та ран, моделі біоплівок ротової порожнини, системи з культурами клітин карциноми й меланоми, пухлини в мишей, історичні повідомлення про пухлини шкіри | Геометрія, глибина, оптичні властивості та допустиме пошкодження тканин організму настільки різняться, що числові параметри антимікробних досліджень ніколи не можна кількісно переносити на дослідження пухлин |
Наведені вище діапазони — це значення, спостережені в дослідженнях, а не рекомендований протокол. Саме цю відмінність і покликана показати таблиця. Широкий розкид опублікованих світлових доз сам по собі свідчить, що універсальної дози світла для метиленового синього не існує. Пов’язаний лабораторний контекст досліджень біоплівок зі світловою активацією наведено в матеріалі про метиленовий синій проти біоплівок, а ширші відомості про шкіру та світлову терапію — у матеріалі про фоточутливість шкіри й основи дозування світла.
Чому однакові значення енергії можуть давати різні біологічні результати
Коли опубліковані параметри цитують без контексту, постійно повторюються чотири непорозуміння.
По-перше, флюенс — це не доза. Два опромінення з однаковою довжиною хвилі та однаковим значенням J per square cm відрізняються, якщо одне проводять швидко, а інше повільно, оскільки виснаження кисню, відновлення під час опромінення та фотовицвітання барвника залежать від швидкості й часу. Зазначення енергії без опроміненості та тривалості впливу залишає опис експерименту неповним.
По-друге, оптичні властивості тканини змінюють значення налаштувань лампи. Через поглинання, розсіювання, геометрію поверхні та зворотне розсіювання флюенс усередині тканини може суттєво відрізнятися від значення, виміряного на вихідному отворі лампи; за даними літератури з клінічної дозиметрії, за певних обставин різниця може наближатися до двократної. Число, скопійоване зі статті, описує геометрію саме цього дослідження, а не будь-яку іншу.
По-третє, локалізація визначає мішень. Катіонний барвник розподіляється в мембранах, мітохондріях, лізосомах, оболонках бактерій або позаклітинному матриксі залежно від форми препарату, заряду, ліпофільності, інтервалу та тканини. Огляд фотохімії 1993 року документує пошкодження нуклеїнових кислот, білків, ліпідів, мембран, органел, вірусів, бактерій, клітин ссавців і пухлинних систем. Саме тому те саме поєднання барвника та світла може спричиняти загибель різними шляхами в різних експериментальних умовах.
По-четверте, кисень витрачається. Висока швидкість надходження флюенсу може випереджати поповнення кисню завдяки дифузії та перфузії й спричиняти тимчасову гіпоксію під час опромінення. У такому разі додаткове світло дає незначний додатковий ефект типу II або не дає його взагалі. Фракціонування та нижчу опроміненість досліджують, зокрема, як способи подолання цього обмеження. Саме тому запаси безпеки та насичення тканин киснем мають бути частиною стандартів клінічної безпеки й нагляду, а не інструкції до лампи.
Процедура під керівництвом клініциста, а не домашній рецепт
Досліджуване лікування проводять там, де одночасно забезпечені діагностика, дозиметрія та нагляд. Фахівець має підтвердити, що саме являє собою ураження та на яку глибину воно поширюється, підібрати форму препарату й інтервал до освітлення відповідно до цієї мішені, відкалібрувати джерело для визначеного поля з визначеною геометрією та стежити за станом шкіри, очей, болем і місцевою реакцією тканин. Базовий огляд розробки фенотіазинієвих сполук представляє весь напрям як оптимізацію зв’язку між структурою та активністю в контрольованих умовах, а не як поєднання барвника з будь-яким червоним світлом.
Домашнє відтворення одночасно не відповідає вимогам до всіх контрольованих змінних. Для побутових ламп рідко вказують калібровану спектральну опроміненість на відстані проведення процедури. Концентрація нанесеного барвника нічого не говорить про частку мономера або внутрішньоклітинну локалізацію. Насичення тканини киснем невідоме й змінюється під час опромінення. Жоден із наведених діапазонів не є підставою для домашнього протоколу, і ця стаття навмисно не містить придатного до застосування рецепта. Читачам, які оцінюють загальну якість доказів, варто звернутися до матеріалу як читати дослідження метиленового синього, перш ніж робити висновки з окремої публікації. Тим, кого цікавлять підходи лише зі світлом, без фотосенсибілізатора, варто почати з матеріалу про терапію червоним світлом без фотосенсибілізатора.
Чого ця стаття не встановлює
Вона не встановлює, що фотодинамічна терапія з метиленовим синім виліковує будь-яке захворювання шкіри, усуває будь-яку інфекцію або лікує будь-яку пухлину. Наведені тут огляди механізмів розглядали вимірювання фотохімічних процесів і порівняння структур барвників; вони не визначали жодної клінічної концентрації чи флюенсу. Зазначені вище діапазони параметрів походять із неоднорідних повідомлень про дослідження за участю людей і моделей на тваринах із різними мішенями, глибинами, формами препарату та кінцевими точками, і їх не можна усереднювати для отримання рекомендацій. Докази щодо конкретних пухлин, зокрема обмеження ранніх клінічних повідомлень про базальноклітинну карциному, саркому Капоші та меланому, оцінюються окремо в добірці досліджень раку. Питання чистоти та джерел постачання матеріалу лабораторної якості є окремими від лікування й розглянуті в матеріалі як вибрати продукт із метиленовим синім.