Метилен зәңгәресе һәм митохондрияләр: электрон күчереше һәм дәлилләр

Янәшә куелган ике препаратны күз алдына китерегез. Икесендә дә сулыш чылбырының I комплексын блоклаучы ротенон белән агуланган баш мие митохондрияләре бар. Берсенә эксперимент ясаучы пипетка белән микромоляр дозада метилен зәңгәресе өсти. Кислород куллану өлешчә торгызыла. Мембранадагы көчәнеш өлешчә кире кайта. Аз күләмдә ATP синтезы яңадан башлана. Күрше кюветада пероксид сенсоры күренешнең икенче яртысын күрсәтә: сынап каралган һәр дозада, кулланылган һәр субстратта водород пероксиды бүленеп чыгу берничә тапкыр арткан.

Ике күрсәткеч тә дөрес. Метилен зәңгәресе — сулыш чылбырының зарарланган өлешен әйләнеп узып, электрон агымын саклый ала торган ташучы; шул ук вакытта бу ташу пероксид арту бәрабәренә башкарыла. Ике фактны да бергә исәптә тотсагыз, метилен зәңгәресенең митохондрия эшчәнлегенә тәэсире турындагы әдәбият аңлаешлы була. Берсен генә исәпкә алсагыз, беренче булып кайсы мәкаләне ачуыгызга карап, ул могҗиза яки куркыныч булып күренә.

Ташу механизмын гади итеп аңлату

Сулыш чылбыры — электроннарны бер буыннан икенчесенә тапшыру юлы. Электроннар I комплекска (NADH аша) яки II комплекска һәм аңа бәйле флавин ферментларына (сукцинат һәм охшаш донорлар аша) керә, III комплекс аша хәрәкәтчән ташучы цитохром c га, аннары IV комплекс аша кислородка күчә. Һәр тапшыру протоннарны эчке мембрана аша күчерә, ә барлыкка килгән градиент ATP синтезын хәрәкәткә китерә. Теләсә кайсы буынны блокласагыз, аңа кадәрге өлештә агым туктый.

Метилен зәңгәресе бу системага параллель ташучы булып кушыла. Аның оксидлашкан формасы чылбырның алдагы өлешендәге ташучылардан электроннар ала һәм төссез кайтарылган формага — лейкометилен зәңгәресенә әверелә. Ул исә электроннарны чылбырның алга таба урнашкан өлешенә тапшыра һәм яңадан зәңгәр төскә керә. Бу ике форма редокс пары турындагы аңлатмада тасвирлана, ә электроннарны тапшыруның киңрәк механизмы гомуми механизмга багышланган аңлатмада карала. Ачык калган сорау — ташучы чылбырга кайдан кире керә: III комплексның Qo урыны дип аталган хинол бәйләү кесәсеннәнме, әллә турыдан-туры цитохром c аша гынамы? Кайсы чыгу юлы өстенлек итүе шартларга бәйле; бу III комплексны әйләнеп узу анализында җентекләп аңлатыла.

Кимерүчеләрдәге өч тикшеренү чынлыкта нәрсәне үлчәгән

Өч тикшеренүдә дә аерып алынган баш мие митохондрияләре кулланылган, ягъни органеллалар күзәнәктән чыгарылып, составы билгеләнгән буферда тотылган. Бөтен күзәнәкләр дә, препарат бирелгән хайваннар да, кеше катнашучылар да булмаган. Концентрацияләр органеллалар тирәсендәге эремәгә карый, кешенең авыз аша кабул итә торган дозасына түгел. Бу чикләрне истә тотсагыз, саннарның мәгънәсе ачык була.

Беренче тикшеренү диңгез дуңгызларының аерып алынган баш мие митохондрияләрендә 100 наномолярдан 2 микромолярга кадәр концентрацияләрдә бер үк препаратта файданы да, аның бәясен дә бәяләгән. Сәламәт митохондрияләрдә буяу тыныч хәлдә кислород куллануны арттырган, әмма ADP белән стимуллаштырылган сулыш алуны үзгәртмәгән, шуңа күрә сулыш алу белән бәйләнгән ATP җитештерү яхшырмаган. I комплекс блокланганда, 2 микромоляр концентрация ATP синтезын минутына бер миллиграммга 46 наномольдән 93 наномольгә кадәр торгызган; гадәти тизлек якынча 1109 булган. III комплекс блокланганда, шул ук доза ATP синтезын якынча 46 дан 63 кә кадәр торгызган; гадәти тизлек якынча 910 булган. Көчәнеш һәм кальцийны үзләштерү өлешчә торгызылган. IV комплексның цианид белән блоклануын әйләнеп узып булмаган, димәк, электроннарның файдалы чыгу ноктасы эшләүче IV комплекска кадәр урнашкан. Һәр торгызылу статистик яктан ышанычлы, әмма кечкенә булган: ATP җитештерүнең гадәти дәрәҗәсенә карата бер цифрлы процентлар гына.

Икенче тикшеренү тычканнарның баш мие кабыгы митохондрияләрендә якынча 1 микромоляр концентрациядә I комплексны әйләнеп узуны раслаган һәм III комплекста чик барлыгын күрсәткән. Ротенон сулыш алуны минутына бер миллиграммга якынча 121 наномоль кислородтан 2 наномольдән дә кимрәк дәрәҗәгә төшергән, ә буяу аны якынча 21 гә — гадәти дәрәҗәнең якынча алтыдан бер өлешенә — күтәргән. Шул ук вакытта мембранадагы көчәнеш тулысынча диярлек торгызылган. Әмма III комплекс блокланганнан соң, 1 дән 5 микромолярга кадәр концентрацияләрдә сулыш алу да, көчәнеш тә торгызылмаган, һәм блоклау буяу китереп чыгарган пероксид сигналын киметкән. Авторлар кайтарылган буяу электроннарын III комплексның Qo урынына тапшыра дип фаразлаган: бу урын биләп алынган булса, ташучыга электроннарны тапшырыр урын калмый.

Өченче тикшеренү тычканнарның, күселәрнең һәм диңгез дуңгызларының баш мие митохондрияләрендә, башлыча 2 микромоляр концентрациядә, бу каршылыкны турыдан-туры тикшергән һәм III комплекс блоклануын әйләнеп узып булуын тапкан. Qo урыны ингибиторы миксотиазол базаль сулыш алуны 88 процентка киметкәндә, буяу кислород куллануны блокланмаган дәрәҗәнең якынча 62 процентына кадәр торгызган. Туры сынауда ярты микромоляр концентрациядәге буяу, хәтта III комплекс блокланган чакта да, тыштан өстәлгән цитохром c ны кайтарган. Бу NADH тан буяу аша цитохром c га, аннары IV комплекска баручы юлны хуплый. Әмма торгызылган сулыш алу гадәти булмаган: өстәлгән ADP кислород куллануны арттыру урынына киметкән, ә ATP синтезын блоклау сулыш алуны стимуллаштырган. Мембрана көчәнеше өлешчә генә торгызылган. Сулыш алу белән ATP синтезы арасындагы бәйләнеш кире юнәлгәндә кислородның күп кулланылуы гадәти энергия җитештерү түгел.

Ни өчен лаборатория нәтиҗәләре аерыла һәм моны нәрсә ачыклый

Аерманы хайван төре белән аңлату беренче булып кире кагыла. Өченче төркем эшне өч төр кимерүчедә кабатлаган һәм аларның барысында да, шул исәптән элек әйләнеп узу юк дип хәбәр ителгән тычкан линиясендә дә, сыйфат ягыннан бер үк әйләнеп узу нәтиҗәсен алган. Чынлыкта концентрацияләр (1 һәм 2 микромоляр), ингибитор дозалары, буферлар, аерып алу ысуллары һәм, иң мөһиме, чагыштырылган энергетик халәтләр аерыла: әйләнеп узу ADP өстәлгәнче иң ачык күренә, һәм нәкъ шул халәттә ADP га парадоксаль җавап барлыкка килә. Шуңа күрә дөрес схема шартларга бәйле ике чыгу юлын күрсәтә: берсе Qo урынында, икенчесе цитохром c да. Ташучы электроннарны җирле химик шартлар мөмкинлек биргән урынга тапшыра.

Пероксид бәясе

Чыгым ягы да торгызылу ягы кебек үк эзлекле күренә. Диңгез дуңгызларындагы эштә буяу тикшерелгән барлык шартларда — тыныч хәлдә, ATP синтезлаганда һәм химик зарарлану вакытында — өч субстратның барысында да пероксид бүленеп чыгуны арттырган. ATP синтезы вакытында, 1 микромоляр концентрациядә, аның бүленеп чыгуы минутына бер миллиграммга якынча 148 пикомольдән 1500 пикомольдән артык дәрәҗәгә күтәрелгән, ә хәтта 100 наномоляр концентрация дә сигналны дүрт тапкырдан күбрәк арттырган. Буяу шулай ук пероксидны бетерүне якынча 2.6 тапкырга акрынайткан, шуңа күрә сигнал тизрәк барлыкка килүне дә, акрынрак бетерелүне дә чагылдыра. Тәкъдим ителгән химик аңлатма — ачыкланырлык супероксид барлыкка килмичә, кайтарылган буяуның кислородны турыдан-туры кайтаруы. Әмма бу әлегә исбатланган адым түгел, ә аңлатма булып кала.

Тычканнардагы эш күренешне файдалы рәвештә катлауландыра. Доза арткан саен пероксид кискен арткан: 2 микромоляр концентрациядә минутына бер миллиграммга якынча 76 пикомоль булган башлангыч дәрәҗәдән 2000 пикомольгә якын дәрәҗәгә күтәрелгән. Ләкин III комплексны блоклау буяу китереп чыгарган өлешне киметкән. Әгәр пероксид кайтарылган буяуның кислород белән реакциясеннән генә барлыкка килсә, чылбырны блоклауның тәэсире шулкадәр зур булмас иде. Ул зур булганга, чылбыр да катнаша. Антиоксидант һәм прооксидант тәэсирләргә күзәтү бу ике яклылыкны киңрәк контекстта карый, ә кислород белән ATP ны чагыштыру анализы ни өчен кислород күрсәткечләре генә энергия турындагы фикерне беркайчан да раслый алмавын аңлата.

Эшчәнлекне торгызу — төзәтү түгел

Кулланылыштан чыгарырга кирәкле гыйбарә — «метилен зәңгәресе митохондрияләрне төзәтәме». Төзәтү тотрыклы үзгәрешне аңлатыр иде: яңадан төзелгән комплекслар, препарат киткәннән соң да сакланган сулыш алу белән ATP синтезы арасындагы бәйләнеш, бөтен күзәнәкләрдә эшчәнлекнең торгызылуы, аннары тере организмда эшчәнлекнең яхшыруы. Өч мәкаләнең берсе дә моны күрсәтми. Алар ясалма химик блоклау вакытында яңа гына аерып алынган органеллаларда электрон юлының тиз арада үзгәрүен күрсәтә; ATP җитештерү гадәти дәрәҗәнең кечкенә өлешләре белән чикләнә, ә сулыш алу белән ATP синтезы арасындагы бәйләнеш кайчак ачыктан-ачык сәер була. Ротенон һәм антимицин — лаборатория кораллары, картаю яки кешедәге митохондриаль авыру модельләре түгел. Мондагы бернәрсә дә сәламәт кешенең энергиясе артуын аңлатмый; бу — кешеләрдәге тикшеренүләргә таянган аерым дәлилләр мәсьәләсе.

Өч чик биохакингка кагылышлы нәтиҗәләрне дөрес тотарга ярдәм итә. Беренчедән, эремәдәге концентрация доза түгел: аерып алынган органеллалар тирәсендәге 0.1 дән 2 микромолярга кадәр концентрация кешенең баш мие митохондриясендә шундый ирекле концентрациягә ирешү өчен авыз аша күпме кабул итәргә кирәклеге турында бернәрсә дә әйтми. Өстәвенә, буяуның туплануы яки чыгарылуы мембрана көчәнешенең үзенә бәйле. Икенчедән, кислород — энергия түгел: буяу кислород куллануны нәтиҗәле фосфорлаштыру аша гына түгел, ә цикллы әйләнеш һәм электроннарның читкә агып китүе аша да арттыра ала. Шуңа күрә ATP һәм көчәнеш күрсәткечләреннән башка респирометрия энергия турында нәтиҗә ясарга нигез бирми. Өченчедән, файда белән йөкләнеш бер җөмләдә булырга тиеш: көчәнеш яки ATP торгызылуы турында әйтеп, шул ук вакытта пероксид артуын төшереп калдыру экспериментны дөрес тасвирламый. Моңа бәйле өстәмә аңлатмалар NAD редокс балансы, дозага җавапның формасы һәм үлчәү ысулларын сайлау кулланмасы материалларында бирелә.

Бер гамәли искәрмә: электрон ташу үзлеге нәкъ шушы молекулага хас. Azure B кебек деметилланган тугандаш кушылмалар да редокс активлыкка ия, әмма үзләрен башкача тота. Шуңа күрә өлешчә таркалган эремә белән эксперимент — таркалмаган буяу белән эксперименттан аерыла. Бу — металларга гына тикшерү урынына тулы фармакопея спецификациясен һәм бастырылган партия документын таләп итүнең бер сәбәбе. Яктыртылган шартларда кулланганда, яктылык тәэсирендә барган химик реакцияләр дә өстәмә искәрмә кертә; бу кызыл яктылык белән бергә куллану материалында карала.

Тар чикләнгән нәтиҗә боларның барысына да бирешми һәм аны сакларга кирәк: метилен зәңгәресе зарарланган, аерып алынган митохондрияләрдә шартларга бәйле электрон ташучы булып эшли ала, пероксид арту бәрабәренә агымны өлешчә саклый. Моннан тыш булган бар нәрсә — энергия, озын гомер, төзәтү — бу тикшеренүләр бирү өчен баштан ук төзелмәгән дәлилләрне көтә.