Methylene blue at mitochondria: paglipat ng elektron at ang ebidensya

Isipin ang dalawang magkatabing preparasyon. Parehong naglalaman ng mitochondria mula sa utak na nilason ng rotenone, isang kemikal na humaharang sa Complex I ng respiratory chain. Sa isa, nagdaragdag ang mananaliksik gamit ang pipette ng micromolar na dosis ng methylene blue. Bahagyang bumabalik ang paggamit ng oxygen. Bahagyang bumabalik ang boltahe ng lamad. Muling nagsisimula ang kaunting paggawa ng ATP. Sa katabing cuvette, ipinapakita ng sensor ng peroxide ang kabilang kalahati ng kuwento: dumami nang ilang ulit ang inilalabas na hydrogen peroxide, sa bawat dosis na sinubukan, sa bawat substrate na ginamit.

Parehong tama ang mga sukat. Ang methylene blue ay tagapagdala ng elektron na kayang panatilihing dumadaloy ang kuryente sa alternatibong daan sa paligid ng nasirang bahagi ng respiratory chain, at may kapalit na peroxide ang parehong paghahatid habang ginagawa nito iyon. Isaalang-alang ang dalawang katotohanan nang sabay, at magiging malinaw ang literatura tungkol sa epekto ng methylene blue sa paggana ng mitochondria. Isa lamang ang isaalang-alang, at magmumukha itong himala o panganib depende sa kung aling papel ang una mong binuksan.

Ang paghahatid ng elektron, sa payak na paliwanag

Ang respiratory chain ay isang hanay ng sunod-sunod na pagpapasa. Pumapasok ang mga elektron sa Complex I (mula sa NADH) o sa Complex II at mga kaugnay na flavin enzyme (mula sa succinate at mga katulad na tagapagbigay), dumaraan sa Complex III patungo sa gumagalaw na tagapagdala na cytochrome c, at pagkatapos ay sa Complex IV patungo sa oxygen. Bawat pagpapasa ay nagbobomba ng mga proton sa kabila ng panloob na lamad, at ang nabubuong gradient ang nagtutulak sa paggawa ng ATP. Harangan ang alinmang istasyon, at titigil ang daloy sa bahaging nauuna rito.

Pumapagitna ang methylene blue bilang isang tagapagdala sa kahilerang ruta. Kinukuha ng oxidized na anyo nito ang mga elektron mula sa mga naunang tagapagdala, at nagiging walang-kulay na reduced na anyo, ang leucomethylene blue. Ipinapasa naman nito ang mga elektron sa mga kasunod na bahagi at bumabalik sa asul. Inilalarawan ang dalawang anyo sa paliwanag tungkol sa pares na redox, at ang mas malawak na kilos ng pagpapasa ay tinalakay sa pangkalahatang paliwanag ng mekanismo. Ang hindi pa tiyak ay kung saan muling pumapasok sa hanay ang tagapagdala: sa bulsa ng Complex III na pinagbubukluran ng quinol, na kilala bilang Qo site, o direkta sa cytochrome c. Nakadepende sa mga kondisyon kung aling labasan ang nangingibabaw, gaya ng detalyadong inilalahad sa pagsusuri sa pagdaan sa alternatibong ruta sa paligid ng Complex III.

Ano talaga ang sinukat ng tatlong pag-aaral sa mga rodent

Gumamit ang lahat ng tatlong pag-aaral ng nakahiwalay na mitochondria mula sa utak, ibig sabihin ay mga organelle na inalis sa selula at isinuspinde sa isang buffer na may tiyak na komposisyon. Walang buo at hindi binagong mga selula, walang mga hayop na binigyan ng dosis, walang mga kalahok na tao. Ang mga konsentrasyon ay tumutukoy sa likidong nakapaligid sa mga organelle, hindi sa dosis na iniinom ng tao. Panatilihing malinaw ang kontekstong iyon, at malinaw ding magsasalita ang mga bilang.

Ang unang pag-aaral, sa nakahiwalay na mitochondria mula sa utak ng guinea pig sa 100 nanomolar hanggang 2 micromolar, ay nagtala ng benepisyo at kapalit nito sa iisang preparasyon. Sa malusog na mitochondria, pinataas ng pangkulay ang paggamit ng oxygen sa pahingang estado ngunit hindi nito binago ang respiration na pinasigla ng ADP, kaya hindi bumuti ang produksyon ng ATP na kaakibat nito. Kapag hinarangan ang Complex I, naibalik ng 2 micromolar ang paggawa ng ATP mula 46 tungo sa 93 nanomoles kada minuto kada milligram, kumpara sa normal na bilis na malapit sa 1109. Kapag hinarangan ang Complex III, naibalik ng parehong dosis ang ATP mula humigit-kumulang 46 tungo sa 63, kumpara sa normal na bilis na malapit sa 910. Bahagyang bumalik ang boltahe at pagsipsip ng calcium. Hindi nalampasan sa alternatibong ruta ang pagharang ng cyanide sa Complex IV, kaya ang kapaki-pakinabang na labasan ng elektron ay nasa bahaging nauuna sa gumaganang Complex IV. Bawat pagpapanumbalik ay makabuluhan sa estadistika ngunit maliit: mga porsiyentong may iisang digit lamang ng normal na produksyon ng ATP.

Ang ikalawang pag-aaral, sa mitochondria mula sa cortex ng mouse sa humigit-kumulang 1 micromolar, ay nagpatibay sa alternatibong pagdaan sa paligid ng Complex I at nagtakda ng hangganan sa Complex III. Pinababa ng rotenone ang respiration mula humigit-kumulang 121 tungo sa mas mababa sa 2 nanomoles ng oxygen kada minuto kada milligram, at pinataas ito ng pangkulay tungo sa humigit-kumulang 21, mga isang ikaanim ng normal, habang halos ganap na bumalik ang boltahe ng lamad. Ngunit matapos harangan ang Complex III, hindi bumalik ang respiration o ang boltahe sa saklaw na 1 hanggang 5 micromolar, at pinahina ng pagharang ang signal ng peroxide na dulot ng pangkulay. Iminungkahi ng mga may-akda na naghahatid ng mga elektron ang reduced na pangkulay sa Qo site ng Complex III: kapag okupado ang lugar na iyon, walang mapaghatiran ang tagapagdala.

Ang ikatlong pag-aaral, sa mitochondria mula sa utak ng mouse, rat at guinea pig, pangunahin sa 2 micromolar, ay direktang sumubok sa hindi pagkakatugma at natuklasang maaaring magkaroon ng alternatibong daan sa paligid ng pagharang sa Complex III. Habang pinababa ng myxothiazol, isang inhibitor ng Qo site, ang basal respiration nang 88 porsiyento, naibalik ng pangkulay ang paggamit ng oxygen sa humigit-kumulang 62 porsiyento ng antas na walang pagharang. Sa isang direktang pagsusuri, nagdulot ang kalahating micromolar ng reduction sa cytochrome c na idinagdag mula sa labas kahit nakaharang ang Complex III, na sumusuporta sa rutang mula NADH, sa pamamagitan ng pangkulay, patungo sa cytochrome c at pagkatapos sa Complex IV. Ngunit hindi normal ang kilos ng naibalik na respiration: pinababa ng idinagdag na ADP ang paggamit ng oxygen sa halip na pataasin ito, at pinasigla ng pagharang sa paggawa ng ATP ang respiration. Bahagya lamang naibalik ang polarisasyon ng boltahe. Ang mataas na paggamit ng oxygen na may baligtad na coupling ay hindi normal na paggawa ng enerhiya.

Bakit hindi nagtutugma ang mga laboratoryo, at ano ang lumilinaw dito

Unang hindi pumapasa ang paliwanag na pagkakaiba ng species ang dahilan. Inulit ng ikatlong grupo ang gawain sa tatlong rodent at nakuha ang parehong uri ng alternatibong pagdaan sa lahat ng mga ito, kabilang ang strain ng mouse kung saan naunang iniulat na wala ang ganitong pagdaan. Ang naiiba sa halip ay ang konsentrasyon (1 kumpara sa 2 micromolar), mga dosis ng inhibitor, mga buffer, mga paraan ng paghihiwalay, at higit sa lahat, ang kalagayan ng enerhiya na inihahambing: pinakamalinaw ang alternatibong pagdaan bago idagdag ang ADP, na siya ring kalagayan kung saan lumilitaw ang salungat-sa-inaasahang tugon sa ADP. Kaya ang diagram na tapat sa ebidensya ay nagpapakita ng dalawang labasang nakadepende sa kondisyon, isa sa Qo site at isa sa cytochrome c. Naghahatid ang tagapagdala kung saan pinapayagan ng lokal na kimika ang paghahatid.

Ang kapalit na peroxide

Kasing-pare-pareho ng pagpapanumbalik ang kapalit nito. Sa pag-aaral sa guinea pig, pinataas ng pangkulay ang paglabas ng peroxide sa bawat kondisyong sinubukan—sa pahingang estado, habang gumagawa ng ATP, at kapag pinahina ng kemikal—sa lahat ng tatlong substrate. Habang gumagawa ng ATP, tumaas ang inilalabas mula humigit-kumulang 148 tungo sa mahigit 1500 picomoles kada minuto kada milligram sa 1 micromolar, at kahit 100 nanomolar ay nagpalakas sa signal nang mahigit apat na ulit. Pinabagal din ng pangkulay ang pag-aalis ng peroxide nang humigit-kumulang 2.6 na beses, kaya ipinapakita ng signal ang mas mabilis na pagbuo kasabay ng mas mabagal na pag-aalis. Ang iminungkahing kimika ay direktang reduction ng oxygen sa pamamagitan ng reduced na pangkulay nang walang natutukoy na superoxide, bagaman nananatili itong interpretasyon sa halip na napatunayang hakbang.

Ginagawang mas masalimuot ng pag-aaral sa mouse ang larawan sa isang kapaki-pakinabang na paraan. Matarik na tumaas ang peroxide kasabay ng dosis, mula sa panimulang antas na malapit sa 76 tungo sa halos 2000 picomoles kada minuto kada milligram sa 2 micromolar, ngunit pinahina ng pagharang sa Complex III ang bahaging dulot ng pangkulay. Kung nagmumula lamang ang peroxide sa reaksiyon ng reduced na pangkulay sa oxygen, hindi dapat ganoon kalaki ang epekto ng pagharang sa hanay. Ngunit malaki ang epekto nito, kaya kasali ang hanay sa proseso. Inilalagay ng pagsusuri sa antioxidant at pro-oxidant ang dalawang magkasalungat na katangiang ito sa mas malawak na konteksto, at ipinapaliwanag ng pagsusuri sa oxygen kumpara sa ATP kung bakit hindi sapat ang mga bilang ng oxygen lamang upang mapatunayan ang isang pahayag tungkol sa enerhiya.

Ang pagpapanumbalik ay hindi pagkukumpuni

Ang pariralang kailangang itigil ay “kinukumpuni ba ng methylene blue ang mitochondria.” Ang pagkukumpuni ay mangangahulugan ng pangmatagalang pagwawasto: mga complex na muling nabuo, coupling na nagpapatuloy matapos mawala ang gamot, paggaling ng paggana sa mga buo at hindi binagong selula, at pagkatapos ay mas mahusay na paggana sa isang buhay na organismo. Wala sa tatlong papel ang nagpapakita niyon. Ang ipinapakita nila ay agarang pagbabago ng ruta sa mga bagong hiwalay na organelle habang artipisyal na hinaharangan ng kemikal, na ang produksyon ng ATP ay maliliit na bahagi lamang ng normal at kung minsan ay may talagang kakaibang coupling. Ang rotenone at antimycin ay mga kasangkapan sa laboratoryo, hindi mga modelo ng pagtanda o sakit sa mitochondria ng tao, at wala rito ang katumbas ng mas maraming enerhiya para sa isang malusog na tao. Iyon ay hiwalay na usapin ng ebidensya na may sarili nitong literatura tungkol sa mga tao.

Tatlong hangganan ang nagpapanatiling tapat sa anumang konklusyon tungkol sa biohacking. Una, ang konsentrasyon sa likidong nakapaligid ay hindi isang dosis: ang 0.1 hanggang 2 micromolar sa paligid ng nakahiwalay na mga organelle ay walang sinasabi tungkol sa kung anong dami ang kailangang inumin upang makamit ang ganoong malayang konsentrasyon sa isang mitochondrion sa utak ng tao, lalo na dahil naiipon o nailalabas ang pangkulay depende sa mismong boltahe ng lamad. Ikalawa, ang oxygen ay hindi enerhiya: maaaring pataasin ng pangkulay ang paggamit ng oxygen sa pamamagitan ng paulit-ulit na cycling at pagtagas, gayundin sa pamamagitan ng phosphorylation na gumagawa ng ATP, kaya ang respirometry na walang mga sukat ng ATP at boltahe ay hindi batayan para sa pahayag tungkol sa enerhiya. Ikatlo, dapat nasa iisang pangungusap ang benepisyo at pasanin: anumang pahayag tungkol sa naibalik na boltahe o ATP na hindi binabanggit ang kasabay na pagtaas ng peroxide ay maling paglalahad ng eksperimento. Kabilang sa mga kaugnay na paglilinaw ang balanse ng redox ng NAD, hugis ng ugnayan ng dosis at tugon at gabay sa mga assay.

Isang praktikal na karagdagang tala: ang paghahatid na ito ay katangian ng eksaktong molekula. Aktibo rin sa redox ang mga kaugnay na molekulang nawalan ng methyl group, tulad ng Azure B, ngunit iba ang kanilang kilos. Kaya ang solusyong bahagyang nasira ay ibang eksperimento kaysa sa hindi pa nasirang pangkulay. Isa iyan sa mga dahilan upang igiit ang buong espesipikasyon ng pharmacopeia at isang inilathalang dokumento ng batch sa halip na pagsusuri para lamang sa mga metal. Ang kimikang dulot ng liwanag ay nagdaragdag ng katulad na pag-iingat para sa mga paggamit na may pag-iilaw, na tinatalakay sa mga kombinasyon sa pulang liwanag.

Nananatiling matibay sa kabila ng lahat ng ito ang limitadong pahayag, at sulit itong panatilihin: maaaring kumilos ang methylene blue bilang tagapagdala ng elektron depende sa mga kondisyon sa nasirang nakahiwalay na mitochondria, na bahagyang nagpapanatili ng daloy kapalit ng peroxide. Lahat ng lampas doon—enerhiya, mahabang buhay, pagkukumpuni—ay naghihintay ng ebidensyang hindi naman idinisenyong ibigay ng mga pag-aaral na ito.