Ang kasaysayan ng methylene blue: mula pangkulay hanggang gamot at pananaliksik

Naabot ng methylene blue ang isang pasyente bago ito nakarating sa isang parmasya.

Ang ulat noong 1891 nina Paul Guttmann at Paul Ehrlich tungkol sa paggamit ng pangkulay sa malaria ay may dalawang tsart ng temperatura. Ang ikalawa ay sumasaklaw mula 13 Hulyo hanggang 5 Agosto, at nakasulat sa gilid ang paggamot sa bawat araw. Ang mga tala noong 18 at 19 Hulyo ay nagsasabing "1 × 0,05 Methylenblau". Sa mga sumunod na araw, nakalista ang lima at pitong dosis ng parehong dami, at pagsapit ng 22 Hulyo ay may maliit na dami na rin ng quinine sa talaan. Ang linya ng lagnat, na pabagu-bago sa pagitan ng 37 °C at 39.5 °C sa unang kalahati ng tsart, ay naging patag matapos lumitaw ang pangkulay at nanatili sa pagitan ng humigit-kumulang 36 °C at 37.5 °C sa natitirang tatlong linggo.

Ang pasyente ay isa sa dalawa, na inilarawan sa papel bilang isang kasambahay at isang marino. Ang compound na natanggap nila ay labinlimang taon nang komersiyal na pangkulay sa tela, at ang dalawang lalaki ay kabilang sa mga unang taong naitalang ginamot gamit ang ganap na sintetikong gamot na nakatuon sa isang partikular na organismo.

Nauna ang pangkulay

Ang unang sintetikong pangkulay na naging matagumpay sa komersiyo ay nilikha ni William Henry Perkin noong 1856. Labingwalong taong gulang si Perkin, nagtatrabaho sa isang laboratoryo sa bahay noong bakasyon ng Pasko ng Pagkabuhay, at sinusubukang mag-synthesize ng quinine. Sa halip ay nakakuha siya ng itim na latak, tinunaw ito, at nakakita ng kulay na mahusay kumapit sa seda. Ipinatente niya ito noong Agosto 1856 at pagsapit ng katapusan ng 1857 ay mayroon na siyang pabrikang nagsusuplay sa isang pagawaan ng pagkulay ng seda sa London.

Noong 1875, nag-synthesize si Adolf von Baeyer ng pulang pangkulay at pinangalanan itong eosin, mula sa Eos, ang salitang Griyego para sa bukang-liwayway. Noong 1876, binuo ni Heinrich Caro, na noon ay direktor ng laboratoryo sa Badische Anilin- und Soda-Fabrik, ang methylene blue kasama si Baeyer bilang isang pangkulay na nakabatay sa aniline para sa bulak. Hindi tuluyang natukoy ang kemikal na estruktura nito hanggang makalipas ang humigit-kumulang siyam na taon.

Makikita pa rin ang pinagmulan na iyon sa paraan ng pagpapangalan sa sangkap. Ang "methylene blue" ay isang pangalang pangkalakalan mula sa katalogo ng mga pangkulay, hindi isang paglalarawang kemikal. Ang compound na tinutukoy nito ay methylthioninium chloride, at mahalaga ang mga pagkakaiba sa pagitan ng pangalan, asin, at mga hydrate nito sa sandaling may magtimbang ng materyal o magbasa ng isang specification.

Ang staining ang naging tulay

Ang landas mula sa pagawaan ng pangkulay patungo sa ospital ay dumaan sa mikroskopyo, at nagsimula ito bago pa umiral ang methylene blue. Si Wilhelm Erb ang unang taong gumamit ng sintetikong pangkulay sa dugo, gamit ang picric acid noong 1865, at nakakita ng reticular na pattern sa loob ng ilang pulang selula.

Inihambing ng tesis doktoral ni Paul Ehrlich noong 1878 ang histological staining sa pagkulay ng mga tela at iginiit na parehong reaksiyong kemikal ang mga ito. Habang nagtatrabaho sa ilalim ni Robert Koch sa tubercle bacillus, hinati niya ang mga aniline dye sa acid at basic na mga klase at itinatag na magkakaibang bahagi ng selula ang kinukulayan ng bawat klase. Noong 1880, pinaghalo niya ang dalawa: isang saturated solution ng methylene blue na ibinuhos sa acid fuchsin hanggang luminaw ang supernatant. Ang resulta, na tinawag niyang neutralen Farbkörper o neutral stain, ay lumikha ng tatlong kulay sa halip na isa, nagpakita ng mga granule sa polymorphonuclear cells na hindi pa nakikita noon, at nagbigay-daan sa unang leukocyte differential count. Dahil sinisipsip ng mga granule na iyon ang dalawang bahagi ng halo, nilikha ni Ehrlich ang salitang neutrophil para sa mga selulang nagtataglay ng mga ito.

Pagkalipas ng dalawang taon, gumamit si Koch ng methylene blue upang makita ang tubercle bacillus, at noong 1883 ay pinahusay ni Ehrlich ang pamamaraan. Noong 1886, naglathala siya ng ibang uri ng obserbasyon: itinurok niya ang pangkulay sa mga buhay na hayop at inihambing kung gaano kalakas itong nasisipsip ng bawat organ, at napagpasyahan niyang mayroon itong kapansin-pansing affinity sa tisyu ng utak at mga nerbiyos. Iniugnay niya ang affinity na iyon sa oxidation-reduction cycling ng pangkulay, na naobserbahan niya noong nakaraang taon. Ang cycling ding iyon ang dahilan kung bakit nawawalan ng kulay ang isang solution ng methylene blue kapag nauubos ang oxygen nito at muling nagkakaroon ng kulay kapag bumalik ang hangin. Ang mga eksperimento na unang sumukat sa mga bunga ng cycling na iyon ay kabilang sa sumunod na dekada, at ang mismong mekanismo ay hiwalay na paksa mula sa kasaysayan.

Ang parasito at ang lilang nucleus

Natuklasan ni Alphonse Laveran ang parasito ng malaria noong 1880 sa pamamagitan ng pagsusuri sa sariwa at hindi na-stain na dugo. Upang regular itong makita sa tuyong smear, kailangan ang isang stain, at pula at asul lamang ang nalilikha ng mga stain noong panahong iyon.

Noong 1888, pinalitan ng Polish na pathologist na si Czesław Cheçinski ang acid fuchsin ng eosin, na lumikha ng halo ng methylene blue at eosin. Ang kasong naging batayan ng kanyang pamamaraan ay isang sundalong namatay sa malaria noong 30 Setyembre 1887. Sa mga blood film, nakakita si Cheçinski ng mga asul na anyong parang bulaklak ng daisy, na kinikilala ngayon bilang Plasmodium malariae, at mga anyong hugis-karit, na kinikilala ngayon bilang mga gametocyte ng Plasmodium falciparum. Sabay na winakasan ng resulta ang dalawang magkatunggaling paliwanag sa sakit: ang miasma theory, at ang pahayag nina Edwin Klebs at Corrado Tommasi-Crudeli na isang bacterium ang sanhi ng malaria.

Nakikita na ang parasito. Hindi pa nakikita ang nucleus nito, kaya nanatiling bukas ang tanong tungkol sa kalikasan nito. Nalutas ni Ernst Malachowski, isang manggagamot sa Breslau, ang problemang iyon nang hindi sinasadya at pagkatapos ay sinadya. Napansin niya ang differential staining ng plasmodial nucleus sa isang preparation noong 1889 ngunit hindi niya ito maulit. Hindi nakatulong ang pag-acidify sa methylene blue. Kapag inalkalina niya ito gamit ang borax, lumilitaw ang epekto sa bawat pagkakataon. Ipinakita niya sa publiko ang technique noong 15 Hunyo 1890 at inilathala ito sa parehong taon, na sinundan ng mas kumpletong pamamaraan noong Agosto 1891.

Inilathala ni Dmitri Romanowsky ang sarili niyang bersyon noong Setyembre 1891. Ang pinakamagagandang resulta niya ay nagmula sa isang napabayaang bote ng solution ng methylene blue na may amag at mahigit dalawang buwan nang nakatago. Sinadya ang pamamaraan ni Malachowski at, ayon sa kanya, madaling ulitin; ang kay Romanowsky ay isang dead end na minsang gumana. Gayunpaman, kay Romanowsky napunta ang eponym, at ang pagtatalo kung sino ang nakalikha ng lilang kulay na nagpakita sa nucleus ay hiwalay na kuwento na may sarili nitong mga dokumento.

Figure: ang ikalawang tsart ng temperatura mula sa ulat nina Guttmann at Ehrlich noong 1891. Sumasaklaw ang itaas na panel mula 13 hanggang 24 Hulyo at ang ibabang panel mula 25 Hulyo hanggang 5 Agosto; tinutukoy ng mga tala sa gilid ang mga dosis na ibinigay, at nananatiling malapit sa normal ang temperatura sa huling tatlong linggo ng talaan. Muling ginawa mula sa ulat ayon sa scan para kina Krafts, Hempelmann at Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Lumabas na demethylation ang ripening

Walang sinumang sangkot noong 1890s ang nakaaalam kung ano ang ginagawa ng "ripening" sa methylene blue. Lumitaw ang sagot mula sa industrial chemistry. Na-synthesize ni Heinrich August Bernthsen ang parent compound na phenothiazine noong 1883, itinatag noong 1885 na kabilang ang methylene blue sa pamilyang iyon, at ipinakita sa parehong panahon na tinatanggal ng alkaline conditions ang mga methyl group mula sa pangkulay, na lumilikha ng mga compound na tinatawag ngayong mga azure.

Kinuha ni Bernard Nocht ang aktibong fraction noong 1898 at 1899 at ang tanging naitawag niya rito ay Rot aus Methylenblau, pula mula sa methylene blue. Kinilala ito ni Michaelis bilang azure I noong 1901. Ipinakilala ni Jenner ang absolute methanol bilang solvent para sa dye precipitate noong 1899, na nag-alis sa pangangailangang i-heat-fix ang mga blood film; pinagsama nina Leishman at Reuter ang dalawang pagsulong; naglathala si Wright ng pinasimpleng pamamaraan noong 1902. Ang ambag ni Giemsa, noong 1902 din, ay ang pagtigil sa pag-asa sa isang solution na random na na-ripen at sa halip ay paggamit ng sinusukat na dami ng mga kilalang dye. Pagkatapos ay tumanggi siyang ilathala kung paano niya ginagawa ang purong methylene azure at ibinenta ang pamamaraan sa laboratoryo ni Dr. Grübler, na nagbenta sa produkto bilang azure I at nag-angking tanging ang bersyon nito ang tunay na Giemsa stain.

Dalawang digmaang pandaigdig ang hindi sinasadyang tumapos sa proseso. Nang hindi na makuha ang mga dye mula Germany, pinag-aralan nina Lillie, Roe at Wilcox ang mga pamalit na gawa sa Amerika at natuklasang ang pinakamahusay na staining ay nagmumula sa tatlong magkakahiwalay na component: purong methylene blue, ang breakdown product nitong azure B, at eosin. Ang tatlong iyon pa rin ang pangunahing component ng stain na ginagamit ngayon upang mag-diagnose ng malaria, sa ilalim ng pangalang pinagsasama na ngayon sina Malachowski, Wright at Giemsa.

Figure: mga ring form ng Plasmodium falciparum sa mga pulang selula ng tao, na na-stain gamit ang isang Romanowsky-type na pamamaraan. Ang lilang estruktura sa loob ng singsing ay ang chromatin na unang nagawang makita gamit ang methylene blue na ginamitan ni Malachowski ng borax. Larawan ni Ernst Hempelmann, inilabas sa public domain.

Isang pangalan, maraming materyal

Ang mga taong naghihiwalay sa mga component na iyon ay nag-iwan ng problemang mas tumagal kaysa sa chemistry. Nilinaw ni Ralph Lillie noong 1969 ang hangganan sa pagitan ng biological stains, na "manufactured to rigid specifications commensurate with their delicate and exacting uses", at non-biological stains para sa pagkulay ng tela, na "require less rigorous and demanding manufacturing standards". Parehong pangalan ang dala ng dalawang uri ng produkto, at ang pagkakaiba sa pagitan ng mga ito ay hindi kailanman simpleng pagkakaiba lamang ng antas. Ang specification na isinulat para sa bulak at ang specification na isinulat para sa isang diagnostic reagent ay hindi mapagpapalit, at ang materyal na ginawa ayon sa specification para sa tela ay hindi nilayon na lunukin.

Ang azure B ang pinakamalinaw na halimbawa. Ito ang monodemethylated form ng methylene blue, mayroon itong sarili nitong nasusukat na pharmacological activity, at mahigit isang siglo itong naroroon bilang hindi kontroladong constituent ng mga clinical preparation ng methylene blue bago may nakapaghiwalay sa dalawa. Natuklasan ng isang grupo na ang tissue ng tao na kinuha sa autopsy matapos ang methylene blue administration ay naglalaman ng 5 hanggang 14 per cent na hindi nagbagong methylene blue at 86 hanggang 95 per cent na azure B. Kung dapat bang maglaman ng azure B ang isang partikular na preparation, at kung hanggang anong limitasyon, ay tanong tungkol sa specification, at mula roon ipinagpapatuloy ito ng pananaliksik sa azure B bilang impurity at metabolite.

Sa specification din makikita ang praktikal na kahihinatnan. Ang pagsunod sa USP ang daan patungo sa pinakamataas na purity na inaalok ng merkado, dahil isa itong kumpletong inilathalang test standard sa halip na isang pagsukat lamang. Saklaw nito ang identity, assay, organic impurities kabilang ang mga azure dye, residual solvents, elemental impurities, residue on ignition, microbial limits, at bacterial endotoxins. Ang certificate na nag-uulat ng resulta para sa heavy metal at tinatawag itong USP compliance ay isang linya lamang ng listahang iyon ang naiulat.

Kinukuha ng Blupreme ang methylene blue nito mula sa isang pharmaceutical manufacturer at inilalathala ang buong certificate of analysis, na sinusuri ang buong USP specification sa halip na heavy metals lamang. Ipinapaliwanag ng gabay sa pagbasa ng certificate of analysis at kung ano ang itinatatag at hindi itinatatag ng USP designation kung paano ihambing ang dokumento sa claim.

Ano ang pinahihintulutan ng kasaysayan, at ano ang hindi

Totoo ang lineage, at mas mahaba ito kaysa sa ipinahihiwatig ng karamihan sa mga product page. Ginamit ang methylene blue sa malaria noong 1891, iniulat bilang sedative sa agitated psychosis noong 1899, at ang side chain nito ay dumaraan sa quinacrine, chloroquine, promethazine at chlorpromazine. Inilarawan ng papel nina Ehrlich at Arthur Leppmann noong 1890 ang pagginhawa sa neuralgic at rheumatic pain, at pagkatapos ay isinaalang-alang ngunit hindi itinuloy ang pagsubok sa pangkulay sa mental illness.

Wala sa mga iyon ang nagtatatag ng modernong paggamit. Ang resulta sa malaria noong 1891 ay mula sa dalawang pasyente at isang tsart ng temperatura. Ang matagal na pagkakakilala sa isang molecule ay dahilan upang pag-aralan ito, hindi isang resulta. Sinasagot ng kasaysayan ng compound bilang gamot at ng mga modernong trial sa malaria ang ibang mga tanong kaysa sa mga itinatanong ni Ehrlich, at kailangang basahin ang mga endpoint ayon sa sarili nilang konteksto.

May isang detalye sa talaan na kabilang sa kasalukuyan sa halip na sa nakaraan. Nang magsagawa ang mga mananaliksik ng methylene blue malaria trials sa Burkina Faso noong 2000s, kinailangan nilang makipagkumpitensya para sa pharmaceutical-grade na materyal, at iniulat nilang tumaas nang humigit-kumulang isang daang ulit ang presyo ng raw material nang magkaroon ito ng GMP validation. Maaaring palitan ang isang pangkulay. Hindi maaaring palitan ang isang gamot. Ang pagkakaibang iginuhit ni Lillie noong 1969 ay ang parehong pagkakaibang tumutukoy sa kung ano ang nilalaman ng isang bote ngayon. :::