บทความ
ประวัติของ methylene blue: จากสีย้อมสู่ยาและงานวิจัย
Methylene blue ไปถึงผู้ป่วยก่อนที่จะไปถึงร้านขายยา
รายงานปี 1891 ของ Paul Guttmann และ Paul Ehrlich เกี่ยวกับการใช้สีย้อมนี้กับมาลาเรียมีกราฟอุณหภูมิสองกราฟ กราฟที่สองครอบคลุมช่วงวันที่ 13 July ถึง 5 August โดยมีการรักษาที่ให้ในแต่ละวันเขียนไว้ตามขอบกราฟ รายการของวันที่ 18 และ 19 July ระบุว่า "1 × 0,05 Methylenblau" วันถัดมาระบุการให้ในปริมาณเท่ากันห้าและเจ็ดครั้ง และเมื่อถึงวันที่ 22 July ก็มีควินินปริมาณเล็กน้อยปรากฏในบันทึก เส้นไข้ซึ่งแกว่งอยู่ระหว่าง 37 °C และ 39.5 °C ในช่วงครึ่งแรกของกราฟราบลงหลังเริ่มใช้สีย้อม และคงอยู่ระหว่างประมาณ 36 °C และ 37.5 °C ตลอดสามสัปดาห์ที่เหลือ
ผู้ป่วยเป็นหนึ่งในสองคน ซึ่งในบทความระบุว่าเป็นคนรับใช้ในบ้านและกะลาสีเรือ สารประกอบที่พวกเขาได้รับเป็นสีย้อมสิ่งทอเชิงพาณิชย์มานานสิบห้าปีแล้ว และชายสองคนนี้อยู่ในกลุ่มบุคคลแรก ๆ ที่มีบันทึกว่าได้รับการรักษาด้วยยาสังเคราะห์ทั้งหมดที่มุ่งเป้าไปยังสิ่งมีชีวิตจำเพาะ
สีย้อมมาก่อน
สีย้อมสังเคราะห์ชนิดแรกที่ประสบความสำเร็จเชิงพาณิชย์สร้างขึ้นโดย William Henry Perkin ในปี 1856 Perkin อายุสิบแปดปี กำลังทำงานในห้องทดลองที่บ้านช่วงวันหยุด Easter และพยายามสังเคราะห์ควินิน แต่เขากลับได้ตะกอนสีดำ เมื่อละลายตะกอนนั้น เขาพบสีที่ติดไหมได้อย่างสดใส เขาจดสิทธิบัตรใน August 1856 และภายในสิ้นปี 1857 ก็มีโรงงานที่จัดส่งสีให้โรงย้อมผ้าไหมแห่งหนึ่งใน London
ในปี 1875 Adolf von Baeyer สังเคราะห์สีย้อมสีแดงและตั้งชื่อว่า eosin ตาม Eos ซึ่งเป็นคำภาษากรีกหมายถึงรุ่งอรุณ ในปี 1876 Heinrich Caro ซึ่งขณะนั้นเป็นผู้อำนวยการห้องปฏิบัติการของ Badische Anilin- und Soda-Fabrik ได้พัฒนา methylene blue ร่วมกับ Baeyer ในฐานะ สีย้อมฐาน aniline สำหรับฝ้าย โครงสร้างทางเคมีของมันยังไม่เป็นที่ยุติจนกระทั่งประมาณเก้าปีต่อมา
ที่มานั้นยังคงเห็นได้จากวิธีเรียกสารนี้ "Methylene blue" เป็นชื่อทางการค้าจากบัญชีรายการสีย้อม ไม่ใช่คำอธิบายทางเคมี สารประกอบที่ชื่อนี้หมายถึงคือ methylthioninium chloride และความแตกต่างระหว่างชื่อ เกลือ และรูป hydrate ของมัน จะมีความสำคัญทันทีที่มีการชั่งสารหรืออ่านข้อกำหนด
การย้อมสีคือสะพานเชื่อม
เส้นทางจากโรงย้อมไปสู่โรงพยาบาลผ่านกล้องจุลทรรศน์ และเริ่มต้นขึ้นก่อนที่ methylene blue จะมีอยู่เสียอีก Wilhelm Erb เป็นคนแรกที่นำสีย้อมสังเคราะห์มาใช้กับเลือด โดยใช้ picric acid ในปี 1865 และพบลวดลายคล้ายร่างแหภายในเซลล์เม็ดเลือดแดงบางเซลล์
วิทยานิพนธ์ปริญญาเอกของ Paul Ehrlich ในปี 1878 เปรียบเทียบการย้อมเนื้อเยื่อทางจุลกายวิภาคกับการย้อมสิ่งทอ และเสนอว่าทั้งสองอย่างเป็นปฏิกิริยาเคมี ขณะทำงานภายใต้ Robert Koch เกี่ยวกับเชื้อ tubercle bacillus เขาแบ่งสีย้อม aniline ออกเป็นกลุ่มกรดและกลุ่มเบส และแสดงให้เห็นว่าแต่ละกลุ่มย้อมส่วนต่าง ๆ ของเซลล์ ในปี 1880 เขาผสมทั้งสองเข้าด้วยกัน โดยเทสารละลาย methylene blue อิ่มตัวลงใน acid fuchsin จนของเหลวส่วนบนใส ผลลัพธ์ที่เขาเรียกว่า neutralen Farbkörper หรือสีย้อมเป็นกลาง ให้สีสามสีแทนที่จะเป็นสีเดียว ทำให้มองเห็น granules ในเซลล์ polymorphonuclear ที่ไม่เคยเห็นมาก่อน และทำให้การนับแยกชนิดเม็ดเลือดขาวครั้งแรกเป็นไปได้ เนื่องจาก granules เหล่านั้นรับสีจากส่วนประกอบทั้งสองของส่วนผสม Ehrlich จึงบัญญัติคำว่า neutrophil สำหรับเซลล์ที่มี granules เหล่านี้
สองปีต่อมา Koch ใช้ methylene blue เพื่อค้นหา tubercle bacillus และในปี 1883 Ehrlich ได้ปรับปรุงวิธีดังกล่าว ในปี 1886 เขาตีพิมพ์ข้อสังเกตอีกแบบหนึ่ง: เขาฉีดสีย้อมเข้าไปในสัตว์ที่ยังมีชีวิต เปรียบเทียบว่าอวัยวะแต่ละส่วนรับสีย้อมมากเพียงใด และสรุปว่าสีย้อมมีความชอบต่อเนื้อเยื่อสมองและเส้นประสาทอย่างเด่นชัด เขาอธิบายว่าความชอบดังกล่าวเกิดจากวัฏจักร oxidation-reduction ของสีย้อม ซึ่งเขาสังเกตเห็นเมื่อปีก่อน วัฏจักรนี้ยังเป็นเหตุผลที่สารละลาย methylene blue สูญเสียสีเมื่อออกซิเจนถูกใช้หมด และกลับมามีสีอีกครั้งเมื่ออากาศกลับเข้าสู่ระบบ การทดลองที่วัดผลของวัฏจักรนี้เป็นครั้งแรก เกิดขึ้นในทศวรรษต่อมา และกลไกนั้นเองเป็นคนละเรื่องกับประวัติศาสตร์
ปรสิตและนิวเคลียสสีม่วง
Alphonse Laveran พบปรสิตมาลาเรียในปี 1880 จากการตรวจเลือดสดที่ไม่ได้ย้อมสี แต่การมองเห็นมันเป็นประจำใน blood smear ที่แห้งจำเป็นต้องใช้สีย้อม และสีย้อมในยุคนั้นให้เพียงสีแดงกับสีน้ำเงิน
ในปี 1888 Czesław Cheçinski นักพยาธิวิทยาชาวโปแลนด์แทนที่ acid fuchsin ด้วย eosin ทำให้ได้ส่วนผสมของ methylene blue และ eosin กรณีที่เป็นพื้นฐานของวิธีนี้คือทหารคนหนึ่งที่เสียชีวิตจากมาลาเรียเมื่อวันที่ 30 September 1887 ในฟิล์มเลือด Cheçinski เห็นรูปทรงสีน้ำเงินคล้ายดอกเดซี่ ซึ่งปัจจุบันระบุว่าเป็น Plasmodium malariae และรูปทรงคล้ายเคียว ซึ่งปัจจุบันระบุว่าเป็น gametocytes ของ Plasmodium falciparum ผลดังกล่าวยุติคำอธิบายโรคที่แข่งขันกันอยู่สองแนวทางพร้อมกัน ได้แก่ ทฤษฎี miasma และข้อเสนอของ Edwin Klebs กับ Corrado Tommasi-Crudeli ที่ว่ามาลาเรียเกิดจากแบคทีเรีย
ตัวปรสิตมองเห็นได้ แต่นิวเคลียสของมันยังมองไม่เห็น ทำให้ธรรมชาติของมันยังเป็นคำถาม Ernst Malachowski แพทย์ใน Breslau แก้ปัญหานี้ได้โดยบังเอิญก่อน แล้วจึงทำซ้ำอย่างตั้งใจ เขาสังเกตเห็นการย้อมแบบแยกส่วนของนิวเคลียส plasmodial ในตัวอย่างหนึ่งเมื่อปี 1889 แต่ไม่สามารถทำซ้ำได้ การทำให้ methylene blue เป็นกรดไม่ได้ช่วย แต่การทำให้เป็นด่างด้วย borax ให้ผลทุกครั้ง เขาสาธิตเทคนิคนี้ต่อสาธารณะเมื่อวันที่ 15 June 1890 และตีพิมพ์ในปีเดียวกัน จากนั้นตีพิมพ์วิธีการที่ละเอียดขึ้นใน August 1891
Dmitri Romanowsky ตีพิมพ์วิธีของตนเองใน September 1891 ผลที่ดีที่สุดของเขามาจากขวดสารละลาย methylene blue ที่ถูกปล่อยทิ้งจนขึ้นราและมีอายุมากกว่าสองเดือน วิธีของ Malachowski เป็นการทำโดยตั้งใจและตามคำของเขาคือทำซ้ำได้ง่าย ส่วนของ Romanowsky เป็นทางตันที่ได้ผลครั้งเดียว ถึงอย่างนั้นชื่อ eponym ก็กลับตกเป็นของ Romanowsky และข้อพิพาทว่าใครเป็นผู้สร้างสีม่วงที่ทำให้นิวเคลียสมองเห็นได้ เป็นอีกเรื่องหนึ่งที่มีเอกสารของมันเอง
ภาพ: กราฟอุณหภูมิกราฟที่สองจากรายงานปี 1891 ของ Guttmann และ Ehrlich แผงด้านบนครอบคลุมวันที่ 13 ถึง 24 July และแผงด้านล่างครอบคลุมวันที่ 25 July ถึง 5 August รายการตามขอบระบุปริมาณที่ให้ และอุณหภูมิอยู่ใกล้ระดับปกติตลอดสามสัปดาห์สุดท้ายของบันทึก ทำซ้ำจากรายงานที่สแกนไว้สำหรับ Krafts, Hempelmann และ Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.
สิ่งที่เรียกว่า ripening แท้จริงคือ demethylation
ไม่มีใครในช่วงทศวรรษ 1890 รู้ว่า "ripening" ทำอะไรกับ methylene blue คำตอบมาจากเคมีอุตสาหกรรม Heinrich August Bernthsen สังเคราะห์สารต้นแบบ phenothiazine ในปี 1883 ยืนยันในปี 1885 ว่า methylene blue อยู่ในตระกูลนี้ และในช่วงเวลาเดียวกันแสดงให้เห็นว่าสภาวะด่างดึงหมู่ methyl ออกจากสีย้อม ทำให้เกิดสารประกอบที่ปัจจุบันเรียกว่า azures
Bernard Nocht สกัดส่วนที่ออกฤทธิ์ได้ในปี 1898 และ 1899 และทำได้เพียงเรียกมันว่า Rot aus Methylenblau หรือสีแดงจาก methylene blue Michaelis ระบุว่าสารนั้นคือ azure I ในปี 1901 Jenner นำ absolute methanol มาใช้เป็นตัวทำละลายสำหรับตะกอนสีย้อมในปี 1899 ซึ่งทำให้ไม่ต้องตรึงฟิล์มเลือดด้วยความร้อนอีกต่อไป Leishman และ Reuter รวมความก้าวหน้าทั้งสองเข้าด้วยกัน ส่วน Wright ตีพิมพ์วิธีที่ง่ายขึ้นในปี 1902 ผลงานของ Giemsa ซึ่งเกิดขึ้นในปี 1902 เช่นกัน คือการเลิกพึ่งสารละลายที่ผ่านการ ripening แบบไม่แน่นอน แล้วใช้ปริมาณที่วัดไว้ของสีย้อมที่ทราบชนิดแทน ต่อมาเขาปฏิเสธที่จะตีพิมพ์วิธีผลิต methylene azure บริสุทธิ์ และขายวิธีดังกล่าวให้ห้องปฏิบัติการของ Dr. Grübler ซึ่งทำตลาดผลิตภัณฑ์ในชื่อ azure I และอ้างว่ามีเพียงผลิตภัณฑ์ของตนเท่านั้นที่เป็น Giemsa stain แท้
สงครามโลกสองครั้งทำให้งานนี้เสร็จสมบูรณ์โดยบังเอิญ เมื่อไม่สามารถหาสีย้อมจากเยอรมนีได้ Lillie, Roe และ Wilcox จึงศึกษาผลิตภัณฑ์ทดแทนจากอเมริกา และพบว่าการย้อมที่ดีที่สุดมาจากส่วนประกอบที่แยกออกจากกันสามชนิด ได้แก่ methylene blue บริสุทธิ์ ผลิตภัณฑ์สลายตัวของมันคือ Azure B และ eosin ทั้งสามยังคงเป็นส่วนประกอบหลักของสีย้อมที่ใช้วินิจฉัยมาลาเรียในปัจจุบัน ภายใต้ชื่อที่ปัจจุบันรวม Malachowski, Wright และ Giemsa เข้าด้วยกัน
ภาพ: รูปวงแหวนของ Plasmodium falciparum ในเซลล์เม็ดเลือดแดงของมนุษย์ ย้อมด้วยวิธีชนิด Romanowsky โครงสร้างสีม่วงภายในวงแหวนคือ chromatin ที่ methylene blue ซึ่งผ่านการปรับด้วย borax ตามวิธีของ Malachowski ทำให้มองเห็นได้เป็นครั้งแรก ภาพโดย Ernst Hempelmann เผยแพร่เป็นสาธารณสมบัติ
ชื่อเดียว วัสดุหลายแบบ
ช่วงเวลาหลายปีที่ต้องใช้ในการแยกส่วนประกอบเหล่านั้นทิ้งปัญหาที่อยู่ยาวกว่าประเด็นทางเคมีไว้ Ralph Lillie ขีดเส้นแบ่งในปี 1969 ระหว่างสีย้อมทางชีววิทยา ซึ่ง "ผลิตตามข้อกำหนดที่เข้มงวดให้เหมาะสมกับการใช้งานที่ละเอียดอ่อนและต้องการความแม่นยำสูง" กับสีย้อมที่ไม่ใช่ทางชีววิทยาสำหรับย้อมสิ่งทอ ซึ่ง "ต้องการมาตรฐานการผลิตที่เข้มงวดและเคร่งครัดน้อยกว่า" ผลิตภัณฑ์ทั้งสองประเภทใช้ชื่อเดียวกัน และความแตกต่างระหว่างสองแบบไม่เคยเป็นเพียงเรื่องระดับความเข้มงวด ข้อกำหนดที่เขียนขึ้นสำหรับฝ้ายกับข้อกำหนดที่เขียนขึ้นสำหรับสารรีเอเจนต์เพื่อการวินิจฉัยไม่สามารถใช้แทนกันได้ และวัสดุที่ผลิตตามข้อกำหนดสำหรับสิ่งทอไม่ได้มีวัตถุประสงค์ให้รับประทาน
Azure B เป็นตัวอย่างที่ชัดเจนที่สุด มันเป็นรูป monodemethylated ของ methylene blue มีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาที่วัดได้ในตัวเอง และเคยอยู่เป็นส่วนประกอบที่ไม่ได้ควบคุมในผลิตภัณฑ์ methylene blue ทางคลินิกมานานกว่าหนึ่งศตวรรษก่อนที่จะมีการแยกทั้งสองออกจากกัน กลุ่มวิจัยหนึ่งพบว่าเนื้อเยื่อมนุษย์ที่เก็บจากการชันสูตรหลังได้รับ methylene blue มี methylene blue ที่ไม่เปลี่ยนแปลงอยู่ 5 ถึง 14 per cent และ Azure B 86 ถึง 95 per cent การที่ผลิตภัณฑ์หนึ่งควรมี Azure B หรือไม่ และควรจำกัดไว้ที่ระดับใด เป็นคำถามเรื่องข้อกำหนด และงานวิจัยเกี่ยวกับ Azure B ในฐานะสิ่งเจือปนและ metabolite กล่าวต่อจากจุดนั้น
ผลในทางปฏิบัติก็อยู่ที่ข้อกำหนดเช่นกัน การเป็นไปตาม USP คือเส้นทางไปสู่ระดับความบริสุทธิ์สูงสุดที่ตลาดมีให้ เพราะ USP เป็นมาตรฐานการทดสอบฉบับสมบูรณ์ที่เผยแพร่ไว้ ไม่ใช่เพียงการวัดค่าเดียว มาตรฐานครอบคลุม identity, assay, organic impurities รวมถึงกลุ่ม azure dyes, residual solvents, elemental impurities, residue on ignition, microbial limits และ bacterial endotoxins ใบรับรองที่รายงานผล heavy-metal เพียงค่าเดียวแล้วเรียกสิ่งนั้นว่าเป็นการปฏิบัติตาม USP ได้รายงานเพียงหนึ่งบรรทัดจากรายการทั้งหมดนี้
Blupreme จัดหา methylene blue จากผู้ผลิตเภสัชภัณฑ์และเผยแพร่ certificate of analysis ฉบับเต็ม โดยทดสอบตามข้อกำหนด USP ทั้งหมดแทนที่จะทดสอบเฉพาะ heavy metals คู่มือการอ่าน certificate of analysis และสิ่งที่คำกำกับ USP ยืนยันและไม่ได้ยืนยัน อธิบายวิธีตรวจสอบเอกสารเทียบกับคำกล่าวอ้าง
สิ่งที่ประวัติศาสตร์รองรับ และสิ่งที่ไม่ได้รองรับ
สายประวัติศาสตร์นี้มีอยู่จริง และยาวนานกว่าที่หน้าผลิตภัณฑ์ส่วนใหญ่ทำให้เข้าใจ Methylene blue ถูกใช้รักษามาลาเรียในปี 1891 มีรายงานว่าใช้เป็นยากล่อมประสาทในภาวะ psychosis ที่มีอาการกระสับกระส่ายในปี 1899 และสายโครงสร้างด้านข้างของมันเชื่อมโยงไปถึง quinacrine, chloroquine, promethazine และ chlorpromazine บทความปี 1890 ของ Ehrlich ร่วมกับ Arthur Leppmann รายงานการบรรเทาอาการปวดแบบ neuralgic และ rheumatic จากนั้นพิจารณาแต่ตัดสินใจไม่ทดสอบสีย้อมนี้ในภาวะเจ็บป่วยทางจิต
ทั้งหมดนั้นไม่ได้ยืนยันการใช้งานสมัยใหม่ ผลจากมาลาเรียในปี 1891 มีผู้ป่วยเพียงสองคนและกราฟอุณหภูมิหนึ่งชุด การคุ้นเคยกับโมเลกุลหนึ่งมาอย่างยาวนานเป็นเหตุผลให้ศึกษา ไม่ใช่ผลลัพธ์ ประวัติของสารประกอบนี้ในฐานะยา และการทดลองสมัยใหม่ในมาลาเรีย ตอบคำถามคนละแบบกับคำถามที่ Ehrlich กำลังถาม และต้องอ่าน endpoints ตามความหมายของมันเอง
มีรายละเอียดหนึ่งในบันทึกที่เป็นเรื่องของปัจจุบันมากกว่าอดีต เมื่อผู้วิจัยทำการทดลอง methylene blue กับมาลาเรียใน Burkina Faso ในช่วงทศวรรษ 2000 พวกเขาพบว่าต้องแข่งขันกันเพื่อให้ได้วัสดุเกรดเภสัชกรรม และรายงานว่าราคาวัตถุดิบเพิ่มขึ้นประมาณหนึ่งร้อยเท่าเมื่อวัสดุนั้นผ่านการรับรอง GMP สีย้อมสามารถใช้วัสดุอื่นแทนได้ ยาไม่สามารถทำเช่นนั้นได้ ความแตกต่างที่ Lillie ขีดไว้ในปี 1969 คือความแตกต่างเดียวกับที่ใช้ตัดสินว่าขวดหนึ่งมีอะไรอยู่ภายในในปัจจุบัน