การทดลองที่เชื่อมโยงเมทิลีนบลูกับการหายใจระดับเซลล์

เลือดมนุษย์ที่กำจัดไฟบรินออกแล้ว เมื่อนำไปบ่มที่ 37 °C เป็นเวลาสามชั่วโมง จะใช้ออกซิเจนประมาณร้อยละสองของออกซิเจนที่มีอยู่ หากเติมเมทิลีนบลูปริมาณเล็กน้อยก่อนบ่ม เลือดเดียวกันนั้นจะใช้ออกซิเจนประมาณร้อยละหกสิบห้า ตัวเซลล์ไม่ได้เปลี่ยนแปลงอะไรเลย มีเพียงสารละลายที่เปลี่ยนไป

ตัวเลขนี้มาจากบทความวิจัยปี 1928 ของ George Harrop และ E. S. Guzman Barron ที่ Johns Hopkins และเป็นต้นทางของข้อความที่มักถูกกล่าวซ้ำว่าเมทิลีนบลูช่วยให้การหายใจระดับเซลล์ดีขึ้น ข้อความนี้ไม่ใช่เรื่องผิด แต่มีความหมายจำกัดกว่าที่ฟังดู

ตัวเลขในตารางวัดอะไรจริง ๆ

สิ่งที่วัดคือการใช้ออกซิเจน ซึ่งตรวจวัดด้วยการวิเคราะห์ก๊าซ Harrop และ Barron กรองเลือดที่เพิ่งเจาะผ่านสำลีที่ 10 °C เพื่อกำจัดเม็ดเลือดขาว ทำให้ตัวอย่างอิ่มตัวด้วยออกซิเจน แบ่งตัวอย่าง เติมสีย้อมลงในส่วนหนึ่ง แล้ววิเคราะห์ทั้งสองส่วนหลังบ่ม จำนวนเม็ดเลือดขาวแทบไม่เคยเกินประมาณหนึ่งพันเซลล์ต่อลูกบาศก์มิลลิเมตร การใช้ออกซิเจนรายงานเป็นสัดส่วนของออกซิเจนตั้งต้นในตัวอย่างที่หายไป

พวกเขาวัดคาร์บอนไดออกไซด์ด้วย แต่ในการวัดนี้ วิธีการกลับสร้างปัญหา เลือดที่กำจัดไฟบรินออกแล้วปล่อยคาร์บอนไดออกไซด์มากถึงสองมิลลิโมลต่อ 100 mL ในชั่วโมงแรกของการบ่ม ด้วยเหตุผลที่ไม่เกี่ยวกับปฏิกิริยาที่ศึกษา จึงใช้อัตราส่วนการหายใจจากเลือดครบส่วนไม่ได้ มีเพียงเซลล์ที่ล้างแล้วในสารละลายของ Locke ที่ให้ค่าซึ่งตีความได้ และค่าเหล่านั้นกระจุกอยู่ระหว่าง 0.73 ถึง 0.80 ทั้งในกรณีที่มีและไม่มีสีย้อม

รายละเอียดนี้ไม่ใช่เรื่องเล็กน้อย “การหายใจ” ในบทความเหล่านี้หมายถึงการแลกเปลี่ยนก๊าซภายในภาชนะปิด ช่องว่างระหว่างการใช้ออกซิเจนกับการผลิตพลังงานที่นำไปใช้ได้ มีการพิจารณาแยกไว้ในบทความเรื่อง การใช้ออกซิเจนบอกอะไรและไม่บอกอะไรเกี่ยวกับ ATP

สีย้อมเพิ่มการหายใจได้มากที่สุดในเซลล์ที่หายใจน้อยที่สุด

เม็ดเลือดแดงระยะโตเต็มที่ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมแทบไม่มีการใช้ออกซิเจนที่วัดได้ แต่เม็ดเลือดแดงของนกซึ่งมีนิวเคลียสมีการใช้ออกซิเจน Harrop และ Barron ทดลองกับทั้งสองแบบ และความแตกต่างนี้เป็นแกนหลักของข้อเสนอของพวกเขา

ในตัวอย่างจากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม สีย้อมทำให้การใช้ออกซิเจนเพิ่มขึ้นยี่สิบถึงห้าสิบเท่า ส่วนในเลือดห่านซึ่งเซลล์หายใจอยู่แล้ว สีย้อมไม่เคยทำให้อัตรานี้เพิ่มเกินสองเท่า ยิ่งการหายใจตั้งต้นสูง สีย้อมก็ยิ่งเพิ่มได้ไม่มาก

แนวโน้มเดียวกันปรากฏภายในสิ่งมีชีวิตชนิดเดียวกันด้วย ตัวอย่างเลือดมนุษย์จากผู้ป่วยโรคเม็ดเลือดแดงมากผิดปกติชนิดโพลีไซทีเมียเวรา ซึ่งมีเซลล์ที่ยังไม่โตเต็มที่ ใช้ออกซิเจนร้อยละ 11.3 โดยไม่มีสีย้อม เทียบกับร้อยละ 2.8 ของเซลล์ที่ล้างแล้วจากผู้บริจาคสุขภาพดี สีย้อมเพิ่มค่านั้นขึ้นเพียงร้อยละ 63.4 เป็นการเร่งประมาณหกเท่า ในขณะที่เซลล์ปกติถูกเร่งเกือบสามสิบเท่า สีย้อมทำให้เซลล์โตเต็มที่มีพฤติกรรมใกล้เคียงเซลล์ที่ยังไม่โตเต็มที่ ซึ่งตรงกับสิ่งที่ผู้เขียนระบุว่ามันกำลังทำ

ไซยาไนด์ควรจะหยุดกระบวนการนี้ได้

เป็นที่ทราบกันว่าไซยาไนด์หยุดการออกซิเดชันระดับเซลล์ได้ แต่ Harrop และ Barron ก็ยังทดลองเติมมันพร้อมกับสีย้อม

ผลจากเลือดวัวเป็นตัวอย่างที่สะท้อนภาพรวมได้ดี เมื่อไม่เติมสิ่งใด ปริมาณออกซิเจนลดจาก 22.61 เหลือ 22.03 เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตรในเวลาสามชั่วโมง เมื่อเติมเมทิลีนบลู ปริมาณลดลงเหลือ 12.84 เมื่อเติมเมทิลีนบลูร่วมกับโพแทสเซียมไซยาไนด์ความเข้มข้นหนึ่งในห้าพันโมลาร์ ปริมาณลดลงเหลือ 12.74 ผลของสีย้อมแทบไม่ได้รับผลกระทบเลย

ภาพ: บันทึกการหายใจระดับจุลภาคอย่างต่อเนื่องของเม็ดเลือดแดงมนุษย์ ลูกศรระบุจุดที่เติมเมทิลีนบลู ก่อนหน้านั้นเส้นกราฟแทบราบ หลังจากนั้นจึงสูงขึ้นอย่างต่อเนื่อง ทำซ้ำจาก Harrop และ Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478

พวกเขาสรุปว่าสีย้อมทำหน้าที่เป็นตัวพาออกซิเจน โดย “เติมสารที่หายไปจากเม็ดเลือดแดงไร้นิวเคลียสของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมระยะโตเต็มที่” สองปีต่อมา Michaelis และ Salomon แห่ง Rockefeller Institute วางกรอบข้อถกเถียงนี้ไว้ในรูปแบบที่ยังคงอยู่จนถึงปัจจุบัน ผลของสีย้อมอาจเป็น “คุณสมบัติโดยบังเอิญของสีย้อม” หรือสีย้อมอาจเป็น “แบบจำลองของสารบางชนิดที่ยังไม่ทราบในสิ่งมีชีวิต” ทางเลือกระหว่างสองคำอธิบายนี้ยังไม่ได้ข้อยุติ สิ่งที่เปลี่ยนไปคือปัจจุบันเราสามารถอธิบายเซลล์เหล่านี้ได้แม่นยำขึ้นมาก

สารสกัดจากตับให้ผลเช่นเดียวกัน

Michaelis และ Salomon แสดงให้เห็นว่าสารสกัดอวัยวะด้วยน้ำเย็นกระตุ้นได้เช่นเดียวกัน ตับหนูแรตให้ผลมากที่สุด ตามด้วยไต ม้าม และอัณฑะ สมอง กล้ามเนื้อ และซีรัมในเลือดให้ผลน้อยหรือไม่มีผลเลย

จากนั้นพวกเขาทดสอบสารสกัดร่วมกับคาร์บอนมอนอกไซด์ การหายใจที่เหนี่ยวนำด้วยสารสกัดหรือสีย้อมไม่เปลี่ยนแปลงในก๊าซผสมที่มีคาร์บอนมอนอกไซด์ร้อยละ 98 และออกซิเจนร้อยละ 2 ก๊าซผสมเดียวกันยับยั้งการหายใจของยีสต์และเม็ดเลือดแดงที่มีนิวเคลียสของไก่ประมาณร้อยละ 60 ถึง 80 สอดคล้องกับ คำอธิบายของ Warburg เกี่ยวกับเอนไซม์การหายใจที่ไวต่อคาร์บอนมอนอกไซด์ ดังนั้นสารในเนื้อเยื่อที่ยังระบุไม่ได้จึงไม่ใช่เอนไซม์ของ Warburg

สารหลายชนิดที่เคยเป็นตัวเลือกถูกตัดออกระหว่างการศึกษา กลูตาไธโอนในรูปรีดิวซ์และซิสเทอีนทำให้มีการใช้ออกซิเจนเพียงเท่าที่จำเป็นต่อการออกซิเดชันของตัวสารเอง โคเอนไซม์ของ Harden และ Young ถูกตัดออก เพราะกล้ามเนื้อมีสารนี้มากที่สุด แต่กลับให้ผลเกือบน้อยที่สุด ไซโตโครมของ Keilin ซึ่งเพิ่งได้รับการตั้งชื่อก่อนหน้านั้นไม่กี่ปี ก็เผชิญกับข้อขัดแย้งเดียวกัน ส่วนข้อเสนอของพวกเขาเองที่ว่าสารออกฤทธิ์มาจากนิวเคลียสของเซลล์ พวกเขาเรียกมันว่าเป็นเพียงข้อเสนอเท่านั้น

ผลที่เกิดขึ้นมีเงื่อนไข

เซลล์ต้องอยู่ในสภาพสมบูรณ์ การทำให้เม็ดเลือดแดงแตกด้วยน้ำกลั่นหรือการแช่แข็งซ้ำ ๆ ทำให้การตอบสนองต่อทั้งสีย้อมและสารสกัดหายไป และหากเม็ดเลือดแดงแตกเพียงบางส่วน การตอบสนองก็ลดลงตามสัดส่วน

น้ำตาลก็จำเป็นเช่นกัน กลูโคส ฟรุกโตส และซูโครสรองรับการหายใจที่เหนี่ยวนำด้วยสีย้อมได้ แต่แมนนิทอลทำไม่ได้ เมื่อไม่มีน้ำตาล การหายใจไม่เกิดขึ้นเลย และดูเหมือนสีย้อมจะทำลายเซลล์ระหว่างกระบวนการนั้น จึงไม่สามารถฟื้นการหายใจได้ด้วยการเติมกลูโคสหนึ่งหรือสองชั่วโมงต่อมา ผู้เขียนเสนอว่าสีย้อมกำลังออกซิไดซ์องค์ประกอบเชิงโครงสร้างที่เซลล์จำเป็นต้องใช้

การให้แสงเพิ่มผลของสีย้อมอย่างมาก แม้ผลนั้นจะเห็นได้ชัดในความมืดก็ตาม สีย้อมอื่นที่รับการรีดิวซ์ได้มีพฤติกรรมต่างกัน: โทลูอิลีนบลูให้ผลเท่ากับหรือมากกว่าเมทิลีนบลู ขณะที่อินดิโกไดซัลโฟเนตแทบไม่มีผล ไม่พบความสัมพันธ์ที่ชัดเจนระหว่างศักย์ออกซิเดชัน-รีดักชันของสีย้อมกับขนาดของผลที่เกิดขึ้น ซึ่งผู้เขียนอธิบายว่าเป็นเพราะความสามารถในการผ่านเยื่อหุ้มเซลล์และความเป็นพิษ

ผลที่เกิดขึ้นสัมพันธ์กับการหมัก ไม่ใช่การหายใจ

งานศึกษาของ Barron ในปี 1930 เปลี่ยนจากเซลล์แขวนลอยมาเป็นชิ้นเนื้อบางจากอวัยวะปกติของหนูแรตและเนื้องอกที่ปลูกถ่าย

ในเนื้อเยื่อที่ไม่มีไกลโคไลซิสในภาวะมีออกซิเจน เมทิลีนบลูไม่ให้ผลหรือกดการใช้ออกซิเจนลงเล็กน้อย: ไตประมาณร้อยละ 14 ตับอ่อนประมาณร้อยละ 14 และตับประมาณร้อยละ 5 ในเนื้อเยื่อที่หมักในภาวะมีออกซิเจน มันเพิ่มการใช้ออกซิเจน: ม้ามประมาณร้อยละ 8 และสมองประมาณร้อยละ 13 การเพิ่มขึ้นในเนื้องอกมีตั้งแต่ประมาณร้อยละ 27 ในมะเร็งเต้านมชนิดคาร์ซิโนมาของมนุษย์ ไปจนถึงมากกว่าร้อยละ 80 ในซาร์โคมาของไก่ชนิด Rous โดยมีสัดส่วนใกล้เคียงกับระดับไกลโคไลซิสในภาวะมีออกซิเจนของเนื้อเยื่อแต่ละชนิด

ภาพ: แต่ละจุดแทนเนื้อเยื่อหนึ่งชนิด แกนนอนคือไกลโคไลซิสในภาวะมีออกซิเจน แกนตั้งคือการเปลี่ยนแปลงการใช้ออกซิเจนหลังเติมเมทิลีนบลู ข้อมูลจาก Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), ตาราง 6, PMID 19869777

จากนั้นการทดลองด้วยไซยาไนด์ก็ให้ผลในทางกลับกัน เมื่อการหายใจของเนื้อเยื่อที่ก่อนหน้านี้ไม่ตอบสนองถูกยับยั้งด้วยไซยาไนด์ และการหมักปรากฏชัดขึ้น สีย้อมก็เพิ่มการใช้ออกซิเจนได้อีกครั้ง: ไตประมาณร้อยละ 59 ตับประมาณร้อยละ 19 ม้ามประมาณร้อยละ 286 และอัณฑะประมาณร้อยละ 200

Barron เสนอว่าสีย้อมอาจใช้ทดสอบความสามารถในการหมักของเซลล์หรือเนื้อเยื่อได้ และปิดท้ายด้วยข้อคาดการณ์ว่า วันหนึ่งการเพาะเลี้ยงเนื้องอกหลายรุ่นในอาหารเลี้ยงที่มีสีย้อมอาจทำให้เมแทบอลิซึมของเนื้องอกเปลี่ยนไปเหมือนเนื้อเยื่อปกติอย่างถาวร นั่นเป็นคำถามวิจัยที่เขียนขึ้นในปี 1930 ไม่ใช่ข้ออ้างด้านการรักษา

สิ่งที่การทดลองเหล่านี้ไม่อาจวัดได้

ในปี 1928 และ 1930 “การหายใจ” หมายถึงการใช้ออกซิเจน อะดีโนซีนไตรฟอสเฟตมีรายงานเป็นครั้งแรกในปี 1929 และการแสดงให้เห็นว่าไมโทคอนเดรียที่แยกออกมาสามารถสร้างพันธะเอสเทอร์กับฟอสเฟตขณะถ่ายโอนอิเล็กตรอนเกิดขึ้นในปี 1949 บทความยุคแรกเกี่ยวกับเมทิลีนบลูจึงไม่มีบทความใดที่สามารถวัดการผลิตพลังงานได้ และไม่มีบทความใดอ้างว่าวัดสิ่งนั้น

ตัวเซลล์เป็นปัญหาประการที่สอง เม็ดเลือดแดงระยะโตเต็มที่ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมไม่มีไมโทคอนเดรีย ในระยะเรติคูโลไซต์ เซลล์กำจัดไมโทคอนเดรียและไรโบโซมด้วยกระบวนการออโตฟาจีแบบเลือกจำเพาะ ด้วยเหตุนี้ เม็ดเลือดแดงโตเต็มที่จึงใช้ไกลโคไลซิสเป็นแหล่งพลังงาน และพึ่งวิถีเพนโทสฟอสเฟตเป็นหลักเพื่อสร้าง NADPH มากกว่า ATP ในการทดลองปี 1928 ไม่มีสายโซ่การถ่ายทอดอิเล็กตรอนอยู่ให้ซ่อมแซม สิ่งที่ใช้ออกซิเจนจึงกำลังทำอย่างอื่น

ปัจจุบันสิ่งอื่นที่ว่านั้นมีคำอธิบายค่อนข้างชัดเจนแล้ว เมทิลีนบลูรับอิเล็กตรอนจากตัวให้อิเล็กตรอนภายในเซลล์และเปลี่ยนเป็นลิวโคเมทิลีนบลู ซึ่งถูกออกซิไดซ์กลับด้วยออกซิเจนโมเลกุล ทำให้วงจรครบ ในเม็ดเลือดแดงมนุษย์ ฟลาวินรีดักเทสที่พึ่ง NADPH และไดซัลไฟด์รีดักเทสที่เกี่ยวข้องทำหน้าที่ในขั้นรีดักชัน งานศึกษาปี 1976 ที่ใช้กลูโคสติดฉลากพบว่า สีย้อมกระตุ้นวิถีเบี่ยงเฮกโซสโมโนฟอสเฟต ผลที่ความเข้มข้นต่ำขึ้นอยู่กับออกซีฮีโมโกลบิน และที่ความเข้มข้นสูงขึ้นคือ 0.1 mM เกิดไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ สีย้อมในรูปรีดิวซ์ที่พบกับออกซิเจนทำให้เกิดเปอร์ออกไซด์ ไม่ใช่พันธะฟอสเฟต

ในไมโทคอนเดรีย ภาพรวมยังเป็นที่ถกเถียงมากกว่าที่บทสรุปทั่วไปยอมรับ งานวิจัยแนวหนึ่งเสนอว่าสีย้อมรับอิเล็กตรอนจากบริเวณคอมเพล็กซ์ I แล้วส่งต่อให้ไซโตโครม c อีกงานหนึ่งพบว่า ในไมโทคอนเดรียของสมองหนูเมาส์ มันไม่สามารถฟื้นการหายใจหลังถูกยับยั้งด้วยแอนติไมซินได้ และระบุว่าตัวรับอิเล็กตรอนอยู่ที่ตำแหน่งจับยูบิควินอลของคอมเพล็กซ์ III แทน งานที่สามพบว่าความเข้มข้นต่ำเพิ่มการใช้ออกซิเจนขณะพัก แต่ไม่เปลี่ยนการหายใจที่ถูกกระตุ้นด้วย ADP ข้อสรุปที่ตรงประเด็นที่สุดคือ การใช้ออกซิเจนที่เหนี่ยวนำด้วยเมทิลีนบลูไม่ได้ขึ้นอยู่กับออกซิเดทีฟฟอสโฟรีเลชันเลย: มันยังคงเกิดขึ้นเมื่อสายโซ่การหายใจถูกยับยั้ง และในตัวอย่างที่ไม่มีสายโซ่นี้

มีการวัดช่องว่างระหว่างสองปริมาณนี้โดยตรงด้วย ในไมโทคอนเดรียที่แยกจากตับหนูแรต การเพิ่มความเข้มข้นของสีย้อมทำให้อัตราส่วนการควบคุมการหายใจลดลงและทำให้ไมโทคอนเดรียบวม ซึ่งผู้เขียนอธิบายว่าเป็น การแยกการถ่ายทอดอิเล็กตรอนออกจากการสร้าง ATP ในออกซิเดทีฟฟอสโฟรีเลชัน ในตับหนูแรตที่ได้รับการไหลผ่านของสารละลาย เมทิลีนบลูเพิ่มการใช้ออกซิเจน ขณะที่อัตราส่วน ATP ต่อ ADP ลดลง

หลักฐานทางคลินิกให้ข้อสรุปเดียวกัน ภาวะเมทฮีโมโกลบินในเลือดรักษาด้วย เมทิลีนบลูประมาณหนึ่งถึงสองมิลลิกรัมต่อกิโลกรัมทางหลอดเลือดดำ ผ่านวิถีรีดักชันที่พึ่ง NADPH และขนาดที่สูงกว่านี้ทำให้เกิดภาวะเดียวกับที่กำลังรักษา บทความปริทัศน์เดียวกันระบุว่า ฤทธิ์แก้พิษสูงที่สุดเมื่อเม็ดเลือดแดงอยู่ในสภาพสมบูรณ์ และลดลงเมื่อมีเม็ดเลือดแดงแตก นี่คือข้อค้นพบเรื่องเม็ดเลือดแดงแตกในปี 1930 ที่ปรากฏอีกครั้งเจ็ดสิบสามปีต่อมาในบริบทของโรงพยาบาล สารประกอบที่ผลเป็นประโยชน์และผลเป็นโทษอยู่คนละด้านของจุดแบ่งขนาดการใช้ ไม่ใช่สารประกอบที่ควรอนุมานขนาดการใช้จากค่าการใช้ออกซิเจน

เหตุใดรุ่นการผลิตจึงเกี่ยวข้องกับเรื่องนี้

Harrop และ Barron สังเกตสิ่งหนึ่งที่ควรกลับมาอ่านอีกครั้ง เมทิลีนบลูเองทำให้เกิดแถบในสเปกโทรสโคประหว่างแถบจำเพาะสองแถบของเมทฮีโมโกลบิน “ซึ่งอาจทำให้สับสนได้ง่ายหากตรวจดูอย่างคร่าว ๆ” สีย้อมสามารถเลียนแบบสารที่กำลังตรวจหาได้

ปัญหาเดียวกันมีมิติทางเคมีด้วย ฟีโนไทอะซีนที่เกี่ยวข้องซึ่งมีอยู่เป็นองค์ประกอบรอง มีพฤติกรรมรีดอกซ์ ความสามารถในการผ่านเยื่อหุ้ม และความเป็นพิษของตัวเอง กรณีที่มีบันทึกไว้กรณีหนึ่งแสดงให้เห็นความสำคัญของเรื่องนี้อย่างเป็นรูปธรรม: ในการศึกษาการเติมไอโอดีนให้เมทิลีนบลู ตัวอย่างที่มี Azure B ประมาณร้อยละ 7 ถึง 8 ให้ผลิตภัณฑ์ส่วนใหญ่เป็น Azure B ที่เติมไอโอดีน ดังนั้นสารเจือปนจึงเป็นตัวหลักของปฏิกิริยา ไม่ใช่เมทิลีนบลู

ใครก็ตามที่ใช้เมทิลีนบลูเป็นรีเอเจนต์ ไม่ว่าจะในห้องปฏิบัติการ ที่โต๊ะย้อมสี หรือในตู้ปลา กำลังทำงานกับส่วนประกอบที่ยังไม่ระบุแน่ชัด หากรุ่นการผลิตนั้นยังไม่ได้รับการตรวจสอบคุณลักษณะ สารที่เกี่ยวข้อง เอกลักษณ์ของสาร สิ่งเจือปนธาตุ ตัวทำละลายตกค้าง และกากตกค้างหลังเผา ล้วนเป็นส่วนหนึ่งของการทดลอง ไม่ใช่เพียงเอกสารประกอบ Blupreme จัดหาเมทิลีนบลูจากผู้ผลิตเภสัชภัณฑ์และเผยแพร่ใบรับรองผลการวิเคราะห์ฉบับเต็ม โดยทดสอบตามข้อกำหนด USP ทั้งหมด ไม่ใช่เฉพาะโลหะหนัก; คู่มืออ่านใบรับรองผลการวิเคราะห์ และบทความเรื่อง การระบุเกรด USP ยืนยันอะไรและไม่ยืนยันอะไร อธิบายวิธีตรวจสอบเอกสารเทียบกับคำกล่าวอ้าง

ตัวเลขนั้นถูกต้องแล้ว

การทดลองปี 1928 และ 1930 ดำเนินอย่างรอบคอบ และข้อสังเกตหลักยังคงได้รับการยืนยัน: สีย้อมที่รับการรีดิวซ์ได้สามารถทำให้เซลล์ที่แทบไม่หายใจใช้ออกซิเจนมากกว่าอัตราขณะพักหลายเท่า โดยไม่ผ่านขั้นตอนที่ไซยาไนด์ยับยั้ง

ความผิดพลาดเกิดขึ้นภายหลัง เมื่ออ่านคำว่า “การหายใจ” ด้วยความหมายสมัยใหม่ การวัดการแลกเปลี่ยนก๊าซบอกว่าอิเล็กตรอนไปถึงออกซิเจน แต่ไม่ได้บอกว่ามีอิเล็กตรอนใดถูกใช้สร้าง ATP และในเซลล์ที่ไม่มีไมโทคอนเดรีย ช่องว่างระหว่างข้อความสองอย่างนี้ก็กว้างที่สุดเท่าที่จะเป็นได้ ภาพรวมที่กว้างขึ้นของสิ่งที่เมทิลีนบลูทำในเซลล์ วางความแตกต่างเดียวกันนี้ไว้ในกรอบที่ครอบคลุมขึ้น ส่วน ประวัติของสารประกอบนี้จากสีย้อมสู่ยา อธิบายว่าสารให้สีสิ่งทอมาสู่การทดลองเหล่านี้ได้อย่างไรตั้งแต่ต้น