Så fungerar metylenblått: elektronöverföring och var elektronerna hamnar

En tillsluten kolv på en laboratoriebänk är den kortaste ärliga introduktionen till hur metylenblått fungerar. Vatten, glukos, en nypa natriumhydroxid och tillräckligt med färgämne för att göra vätskan djupt och omisskännligt blå. Vänta några minuter så försvinner det blå tills kolven ser ut som om den innehåller vatten. Skaka den, så kommer färgen tillbaka direkt. Sedan bleknar den igen, och det fortsätter så länge det finns glukos som kan avge elektroner och syre som kan ta emot dem.

Ingenting hos färgämnet har förändrats förutom antalet elektroner det bär på. I oxiderad form är det blått. I reducerad form är det inte det. Nästan allt annat i den terapeutiska litteraturen och forskningslitteraturen om denna molekyl följer av detta enda reversibla steg, eftersom en molekyl som kan ta elektroner från en partner och lämna dem vidare till en annan fungerar som ett relä, och ett relä gör ingenting på egen hand. Vad det gör beror helt på vad som finns i vardera änden.

Två former och varför paret spelar roll

Den oxiderade formen är ett plant, positivt laddat ringsystem. Den platta, laddade formen är orsaken till att den staplas mot nukleinsyror, binder till sialylerade strukturer på cellmembran och starkt absorberar synligt ljus mellan ungefär 600 och 700 nanometer, den del av spektrumet som det mänskliga ögat uppfattar som blått.

Den reducerade formen fungerar annorlunda. Den saknar laddning, löser sig i fett snarare än vatten och är färglös. Dess jonisering är mycket låg vid pH-värdet inne i kroppen, i storleksordningen några få procent. Därför kan den reducerade molekylen lätt passera ett cellmembran genom diffusion, och väl inne i cellen, där miljön är mer oxiderande, kan den återoxideras och i praktiken bli kvar där. Det oxiderade ringsystemet är plant; det reducerade kan vrida sig. Dessa strukturella följder, liksom själva färgförändringen, hör till berättelsen om de två formerna i sig och behandlas mer ingående i jämförelsen mellan metylenblått och leukometylenblått.

Att ta emot elektroner

Det oxiderade färgämnet kan ta emot elektroner från många olika donatorer. Glukoset i demonstrationskolven är en. Inne i en cell är reducerade pyridinnukleotider och komponenter i mitokondriernas elektrontransportkedja andra exempel. När metylenblått reduceras i en vävnad som innehåller syre förbrukar den cykel som uppstår både reduktionsmedlet och syret och bildar reaktiva syreföreningar, främst väteperoxid. Färgämnet kommer ut ur cykeln oförändrat och är redo att gå igenom den på nytt.

Den sista punkten förklarar en motsägelse som annars kan verka slarvig. Metylenblått beskrivs i litteraturen både som prooxidant och antioxidant, och båda beskrivningarna går att försvara. Det kan minska produktionen av superoxid genom att fungera som en artificiell elektronacceptor och leda elektronflödet bort från de enzymställen där syre annars skulle omvandlas till superoxidradikaler. I levercellskulturer har det visats inducera antioxidativa försvarsenzymer i fas 2, däribland tioredoxinreduktas 1 och NADPH-kinonoxidoreduktas. Vilken av de två sidorna man ser beror på vilken ände av reläet som har underskott på elektroner i det ögonblicket. En fråga som "är metylenblått en antioxidant" är inte välformulerad förrän man anger i vilket system, vid vilken koncentration och med vilka andra ämnen närvarande.

Att lämna elektroner vidare

När färgämnet väl håller en extra elektron kan tre helt olika saker hända härnäst, och de beskrivs ofta under en och samma rubrik. Det borde de inte göra.

Det kan lämna elektronen vidare till ett metallcentrum. Det tydligaste exemplet är hemoglobin som har oxiderats från ferrojärn till ferrijärn. I det tillståndet kan det inte transportera syre. I röda blodkroppar reducerar ett enzym färgämnet, varefter det reducerade färgämnet överför elektroner icke-enzymatiskt till det oxiderade hemjärnet, återställer fungerande hemoglobin och återför färgämnet till dess oxiderade form. Färgämnet förbrukas inte i processen; det cirkulerar. Den kliniska situation som bygger på denna reaktion hör hemma i sjukhusvården, och förklaringen av metylenblått vid methemoglobinemi beskriver hur det används och varför användningen övervakas så noggrant.

En viktig anmärkning om källorna: de två översiktsartiklar som denna artikel bygger på anger inte samma reducerande kofaktor för enzymsteget. Den ena anger NADH och den andra NADPH. Oenigheten finns faktiskt i de tillgängliga källorna och är inte löst där, så den säkra beskrivningen är vilken roll varje del spelar snarare än att ange ett enda namn på kofaktorn.

Det kan överföra energi, eller en elektron, till syre om ljus finns närvarande. Denna väg existerar endast under belysning. Det exciterade färgämnet når ett triplettillstånd, och därifrån är två mekanismer möjliga. I den första interagerar det exciterade färgämnet direkt med en närliggande molekyl genom att ta upp väte eller överföra en elektron, vilket bildar radikaler; en sådan reaktion med vatten bildar hydroxylradikaler. I den andra överförs excitationsenergin till själva syret och bildar singlettsyre, en starkt elektrofil art som sönderfaller inom mikrosekunder och allmänt anses vara den huvudsakliga vägen genom vilken belyst metylenblått skadar mikrobiella celler. Reaktioner med lipider och peptider i cellhöljet samt med guaninbaser i DNA hör till de dokumenterade följderna.

Den praktiska följden av denna väg är att belysning förändrar värdena med flera storleksordningar. I de data som sammanställdes av Wainwright och Crossley har metylenblått mot Pseudomonas aeruginosa en minsta baktericid koncentration på omkring 500 mikromolar i mörker och omkring 25 mikromolar vid en ljusdos på 12 joule per kvadratcentimeter. Mot en stam av Staphylococcus aureus är värdena både i mörker och under belysning 5 mikromolar. Med andra ord är frågan om molekylen överhuvudtaget fungerar antimikrobiellt inte en egenskap hos molekylen ensam; den är en egenskap hos molekylen tillsammans med ljuset.

Det kan verka direkt vid ett enzymställe, utan reläet. Metylenblått oxiderar det ferrojärn som är bundet till kväveoxidsyntas, vilket inaktiverar enzymet. Det blockerar lösligt guanylatcyklas, och mellan 1 och 10 mikromolar är den rutinmässiga laboratoriekoncentration som används för detta ändamål. Det hämmar monoaminoxidas typ A med ett IC50 mellan 27 och 180 nanomolar, vilket är mekanismen bakom den väldokumenterade interaktionen med serotoninåterupptagshämmare och anledningen till att läkemedelsinteraktioner med metylenblått utgör en egen kategori.

Dessa tre vägar är kemiskt åtskilda. Att slå samman dem till ett enda påstående om att metylenblått fungerar genom redoxcykling är den främsta orsaken till att så mycket som skrivs om ämnet samtidigt låter tvärsäkert och vagt.

Fyra skillnader som avgör om ett mekanismpåstående betyder något

Vilken form. Det reducerade färgämnet är inte utbytbart mot det oxiderade. Hämning av acetylkolinesteras visar problemet: under en lång in vitro-inkubation reduceras metylenblått gradvis till sin färglösa form, och hämningen avtar eftersom den reducerade molekylen inte hämmar det enzymet. En analys som pågår tillräckligt länge för att formen ska förändras kommer att rapportera en svagare effekt och riskerar att leda till fel förklaring.

Vilken koncentration. Laboratorieintervallet för hämning av lösligt guanylatcyklas är 1 till 10 mikromolar. För att slå ut glutamatmedierad transmission i hippocampusskivor från råtta krävdes 5 till 50 mikromolar. Toxiska effekter i cellkultur har rapporterats över 100 mikromolar. Det handlar inte om samma experiment, och en mekanism som bekräftats vid 50 mikromolar är inte automatiskt relevant för en patient vars plasmakoncentration bara är en bråkdel av detta.

Vilken administreringsväg. Den absoluta orala biotillgängligheten är omkring 72 procent, och den terminala plasmahalveringstiden är 5 till 7 timmar. Oral administrering ger högre koncentrationer i tarmen och levern; intravenös administrering ger högre koncentrationer i hjärnan. Administreringsvägen avgör vilken vävnad som möter elektronerna.

Vilken modell, och om lamporna var tända. En stor del av den mekanistiska litteraturen bygger på cellkulturer och gnagare, och in vitro-resultat för denna molekyl beror på ljusexponering, membranpotential och cellernas redoxtillstånd, eftersom en mikroskoplampa räcker för att fotosensibilisera den. Mellan 65 och 85 procent av en administrerad dos reduceras till den färglösa formen i röda blodkroppar och perifer vävnad. Var och en av dessa variabler ligger mellan en ren mekanism i en odlingsskål och ett påstående om en människa.

Varför renhetsfrågan är en kemifråga

Belysning demetylerar metylenblått. Den första produkten är Azure B, därefter Azure A och sedan tionin, och högre ljusintensitet ger mer nedbrytning än lägre. En molekyl vars användbarhet bygger på förmågan att ta emot och avge elektroner är därför också en molekyl vars sannolika nedbrytningsprodukter är närbesläktade kemiska föreningar som stannar kvar i samma lösning. Sammansättningen av innehållet i behållaren är inte en kosmetisk detalj.

Det är därför överensstämmelse med USP-specifikationen är det relevanta testet för en köpare. En produkt som inte uppfyller den är ett färgämne, och ett färgämne kan innehålla föroreningar, däribland Azure B, tungmetaller och rester av lösningsmedel, som den som sväljer produkten inte vill få i sig. Ytterligare en fallgrop är en säljare som endast testar för tungmetaller och presenterar resultatet som fullständig efterlevnad. Blupreme samarbetar med en läkemedelstillverkare av metylenblått och testar hela specifikationen: identitet, renhet, organiska föroreningar, rester av lösningsmedel, elementära föroreningar, glödgningsrest, mikrobiella gränsvärden och bakteriella endotoxiner. Laboratorietestdokumentet för varje batch publiceras, och att välja leverantör handlar till stor del om att kontrollera om dokumentet finns och vad det omfattar.

Ett reversibelt par. Flera vägar ut från det. Vägen avgör vad påståendet kan innebära.