Metylenblåtts historia: från färgämne till läkemedel och forskning

Metylenblått nådde en patient innan det nådde ett apotek.

Rapporten från 1891 av Paul Guttmann och Paul Ehrlich om färgämnets användning vid malaria innehåller två temperaturdiagram. Det andra sträcker sig från 13 juli till 5 augusti, med behandlingen angiven längs marginalen dag för dag. Anteckningarna den 18 och 19 juli lyder "1 × 0,05 Methylenblau". De följande dagarna anges fem och sju doser av samma mängd, och den 22 juli har även en liten mängd kinin lagts till i journalen. Feberkurvan, som pendlar mellan 37 °C och 39.5 °C under diagrammets första hälft, planar ut efter att färgämnet introduceras och ligger kvar mellan cirka 36 °C och 37.5 °C under de återstående tre veckorna.

Patienten var en av två, som i artikeln beskrivs som en tjänare och en sjöman. Ämnet de fick hade varit ett kommersiellt textilfärgämne i femton år, och de två männen hör till de första dokumenterade personerna som behandlades med ett helt syntetiskt läkemedel riktat mot en specifik organism.

Färgämnet kom först

Det första kommersiellt framgångsrika syntetiska färgämnet skapades av William Henry Perkin 1856. Perkin var arton år, arbetade i ett hemmalaboratorium under ett påsklov och försökte syntetisera kinin. I stället fick han en svart restprodukt, löste upp den och fann en färg som fäste briljant på silke. Han patenterade den i augusti 1856 och hade i slutet av 1857 en fabrik som levererade till ett sidenfärgeri i London.

År 1875 syntetiserade Adolf von Baeyer ett rött färgämne och gav det namnet eosin, efter Eos, det grekiska ordet för gryningen. År 1876 utvecklade Heinrich Caro, då chef för laboratoriet vid Badische Anilin- und Soda-Fabrik, metylenblått tillsammans med Baeyer som ett anilinbaserat färgämne för bomull. Dess kemiska struktur fastställdes inte förrän omkring nio år senare.

Det ursprunget syns fortfarande i hur ämnet benämns. "Metylenblått" är ett handelsnamn från färgämneskatalogen, inte en kemisk beskrivning. Föreningen som avses är metyltioniniumklorid, och skillnaderna mellan namnet, saltet och dess hydrater blir viktiga så snart någon väger materialet eller läser en specifikation.

Färgning blev länken

Vägen från färgverk till sjukhus gick genom mikroskopet och började innan metylenblått ens fanns. Wilhelm Erb var den första personen som använde ett syntetiskt färgämne på blod, med pikrinsyra 1865, och såg ett retikulärt mönster inuti vissa röda blodkroppar.

Paul Ehrlichs doktorsavhandling från 1878 jämförde histologisk färgning med textilfärgning och hävdade att båda var kemiska reaktioner. Under arbetet med tuberkelbacillen hos Robert Koch delade han in anilinfärgämnen i sura och basiska klasser och fastställde att varje klass färgade olika delar av en cell. År 1880 blandade han de två: en mättad lösning av metylenblått hälldes i sur fuchsin tills supernatanten klarnade. Resultatet, som han kallade neutralen Farbkörper eller neutralfärgning, gav tre färger i stället för en, synliggjorde granula i de polymorfonukleära cellerna som tidigare inte hade varit synliga och gjorde den första differentialräkningen av leukocyter möjlig. Eftersom dessa granula tog upp båda komponenterna i blandningen myntade Ehrlich ordet neutrofil för de celler som bar dem.

Två år senare använde Koch metylenblått för att identifiera tuberkelbacillen, och 1883 förbättrade Ehrlich metoden. År 1886 publicerade han en annan typ av observation: han injicerade färgämnet i levande djur och jämförde hur starkt varje organ tog upp det, och drog slutsatsen att det hade en tydlig affinitet för hjärn- och nervvävnad. Han tillskrev denna affinitet färgämnets oxidations-reduktionscykling, som han hade observerat året innan. Denna cykling är också anledningen till att en lösning av metylenblått förlorar sin färg när dess syre förbrukas och återfår den när luft återkommer. De experiment som först mätte konsekvenserna av denna cykling hör till ett senare årtionde, och själva mekanismen är ett separat ämne från historien.

Parasiten och den lila kärnan

Alphonse Laveran upptäckte malariaparasiten 1880 genom att undersöka färskt, ofärgat blod. För att rutinmässigt se den i ett torkat utstryk krävdes en färgning, och dåtidens färgningar gav bara rött och blått.

År 1888 ersatte den polske patologen Czesław Cheçinski sur fuchsin med eosin och skapade en blandning av metylenblått och eosin. Fallet bakom hans metod gällde en soldat som hade avlidit i malaria den 30 september 1887. I blodutstryken såg Cheçinski blå prästkrageliknande former, som nu identifieras som Plasmodium malariae, och skärformade former, som nu identifieras som gametocyter av Plasmodium falciparum. Resultatet satte samtidigt punkt för två konkurrerande förklaringar till sjukdomen: miasmateorin och Edwin Klebs och Corrado Tommasi-Crudelis påstående att malaria orsakades av en bakterie.

Parasiten var synlig. Dess kärna var det inte, vilket lämnade dess natur oklar. Ernst Malachowski, läkare i Breslau, löste problemet först av en slump och sedan avsiktligt. Han lade 1889 märke till differentialfärgning av plasmodiets kärna i ett preparat och kunde inte återskapa resultatet. Att surgöra metylenblåttet hjälpte inte. Att alkalisera det med borax gav effekten varje gång. Han demonstrerade tekniken offentligt den 15 juni 1890 och publicerade den samma år, med en mer fullständig metod i augusti 1891.

Dmitri Romanowsky publicerade sin egen version i september 1891. Hans bästa resultat kom från en försummad, möglig flaska med metylenblå lösning som var mer än två månader gammal. Malachowskis beskrivning var avsiktlig och, med hans egna ord, lätt att reproducera; Romanowskys var en återvändsgränd som fungerade en gång. Eponymen gick ändå till Romanowsky, och tvisten om vem som framställde den lila färg som gjorde kärnan synlig är en separat historia med egna dokument.

Figur: det andra temperaturdiagrammet från Guttmann och Ehrlichs rapport från 1891. Den övre panelen omfattar 13 till 24 juli och den nedre panelen 25 juli till 5 augusti; anteckningarna i marginalen anger de givna doserna, och temperaturen ligger nära det normala under registreringens sista tre veckor. Återgiven från rapporten såsom den skannats för Krafts, Hempelmann och Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Mognad visade sig vara demetylering

Ingen av dem som var inblandade på 1890-talet visste vad "mognad" gjorde med metylenblått. Svaret kom från industrikemin. Heinrich August Bernthsen hade syntetiserat moderföreningen fenotiazin 1883, fastställde 1885 att metylenblått tillhörde den familjen och visade under samma period att alkaliska förhållanden avlägsnar metylgrupper från färgämnet och bildar de föreningar som nu kallas azurer.

Bernard Nocht extraherade den aktiva fraktionen 1898 och 1899 och kunde bara kalla den Rot aus Methylenblau, rött från metylenblått. Michaelis identifierade den som azure I 1901. Jenner introducerade absolut metanol som lösningsmedel för färgämnesfällningen 1899, vilket tog bort behovet av att värmefixera blodutstryk; Leishman och Reuter kombinerade båda framstegen; Wright publicerade en förenklad metod 1902. Giemsas bidrag, också 1902, var att sluta förlita sig på en slumpmässigt mognad lösning och i stället använda uppmätta mängder av kända färgämnen. Han avstod därefter från att publicera hur han framställde ren methylene azure och sålde metoden till Dr. Grüblers laboratorium, som marknadsförde produkten som azure I och hävdade att endast dess version var äkta Giemsa-färgning.

Två världskrig avslutade arbetet av en slump. När tyska färgämnen inte längre gick att få tag på arbetade Lillie, Roe och Wilcox med de amerikanska ersättningarna och fann att den bästa färgningen kom från tre separerade komponenter: rent metylenblått, dess nedbrytningsprodukt Azure B och eosin. Dessa tre är fortfarande huvudkomponenterna i den färgning som används för att diagnostisera malaria i dag, under ett namn som nu förenar Malachowski, Wright och Giemsa.

Figur: ringformer av Plasmodium falciparum i mänskliga röda blodkroppar, färgade med en metod av Romanowsky-typ. Den lila strukturen inuti ringen är det kromatin som Malachowskis boraxbehandlade metylenblått gjorde synligt för första gången. Bild av Ernst Hempelmann, publicerad som public domain.

Ett namn, flera material

Åren som skilde dessa komponenter åt lämnade efter sig ett problem som överlevde själva kemin. Ralph Lillie drog 1969 gränsen mellan biologiska färgämnen, "tillverkade enligt strikta specifikationer anpassade till deras känsliga och krävande användningsområden", och icke-biologiska färgämnen för textilfärgning, som "kräver mindre strikta och krävande tillverkningsstandarder". Båda typerna av produkt bar samma namn, och skillnaden mellan dem var aldrig en gradskillnad. En specifikation skriven för bomull och en specifikation skriven för ett diagnostiskt reagens är inte utbytbara, och ett material som tillverkats enligt textilspecifikationen var inte avsett att sväljas.

Azure B är det tydligaste exemplet. Det är den monodemetylerade formen av metylenblått, det har mätbar farmakologisk aktivitet i sig och förekom som en okontrollerad beståndsdel i kliniska preparat av metylenblått i mer än ett sekel innan någon separerade de två. En forskargrupp fann att mänsklig vävnad som provtagits vid obduktion efter administrering av metylenblått innehöll 5 till 14 per cent oförändrat metylenblått och 86 till 95 per cent Azure B. Huruvida ett visst preparat bör innehålla Azure B, och vid vilken gräns, är en specifikationsfråga, och forskningen om Azure B som förorening och metabolit tar vid där.

Det är också i specifikationen som den praktiska konsekvensen finns. Överensstämmelse med USP är vägen till den högsta renhet som marknaden erbjuder, eftersom det är en fullständig publicerad teststandard snarare än en enskild mätning. Den omfattar identitet, haltbestämning, organiska föroreningar inklusive azurfärgämnena, restlösningsmedel, elementära föroreningar, glödgningsrest, mikrobiella gränsvärden och bakteriella endotoxiner. Ett certifikat som redovisar ett resultat för tungmetaller och kallar det USP-överensstämmelse har redovisat en rad i den listan.

Blupreme köper sitt metylenblått från en läkemedelstillverkare och publicerar det fullständiga analyscertifikatet, med testning mot hela USP-specifikationen snarare än enbart tungmetaller. Guiden till hur man läser ett analyscertifikat och vad USP-beteckningen fastställer och inte fastställer beskriver hur dokumentet kan kontrolleras mot påståendet.

Vad historien ger stöd för, och vad den inte gör

Historiken är verklig och längre än de flesta produktsidor antyder. Metylenblått användes för att behandla malaria 1891, rapporterades som lugnande medel vid agiterad psykos 1899, och dess sidokedja löper genom kinakrin, klorokin, prometazin och klorpromazin. Ehrlichs artikel från 1890 tillsammans med Arthur Leppmann beskrev lindring av neuralgisk och reumatisk smärta och övervägde därefter, men avstod från, att testa färgämnet vid psykisk sjukdom.

Inget av detta fastställer en modern användning. Malariaresultatet från 1891 omfattade två patienter och ett temperaturdiagram. Lång erfarenhet av en molekyl är ett skäl att studera den, inte ett resultat. Historien om föreningen som läkemedel och de moderna studierna vid malaria besvarar andra frågor än dem Ehrlich ställde, och utfallsmåtten måste bedömas på sina egna villkor.

Det finns en detalj i dokumentationen som hör till nutiden snarare än det förflutna. När forskare genomförde malariastudier med metylenblått i Burkina Faso på 2000-talet konkurrerade de om material av farmaceutisk kvalitet och rapporterade att priset på råvaran hade ökat med ungefär en faktor hundra när den hade GMP-validering. Ett färgämne kunde ersättas. Ett läkemedel kunde det inte. Den åtskillnad som Lillie gjorde 1969 är samma åtskillnad som avgör vad en flaska innehåller i dag. :::