Experimenten som kopplade metylenblått till cellandning

Defibrinerat människoblod som hålls vid 37 °C i tre timmar förbrukar omkring två procent av det syre det innehåller. Tillsätt en liten mängd metylenblått före inkubationen, så förbrukar samma blod omkring sextiofem procent. Inget hos cellerna förändrades. Bara lösningen.

Den siffran kommer från en artikel från 1928 av George Harrop och E. S. Guzman Barron vid Johns Hopkins, och den är ursprunget till det ofta upprepade påståendet att metylenblått förbättrar cellandningen. Påståendet är inte falskt, men det är snävare än det låter.

Vad siffran i tabellen faktiskt mäter

Mätvariabeln var syreupptag, bestämt genom gasanalys. Harrop och Barron filtrerade nytaget blod genom bomull vid 10 °C för att avlägsna de vita blodkropparna, mättade provet med syre, delade det, tillsatte färgämne till den ena delen och analyserade båda efter inkubation. Antalet leukocyter översteg sällan omkring tusen per kubikmillimeter. Syreförbrukningen rapporterades som den andel av provets ursprungliga syreinnehåll som hade försvunnit.

De mätte också koldioxid, och där ställde metoden till problem. Defibrinerat blod frigjorde upp till två millimol koldioxid per 100 mL under den första inkubationstimmen av skäl som inte hade med den undersökta reaktionen att göra, så respiratoriska kvoter från helblod var oanvändbara. Bara tvättade celler i Lockes lösning gav tolkningsbara värden, och dessa låg mellan 0.73 och 0.80 både med och utan färgämnet.

Den detaljen är inte oväsentlig. ”Respiration” i dessa artiklar betyder gasutbyte i ett slutet kärl. Skillnaden mellan syreförbrukning och användbar energiproduktion undersöks separat i vad syreförbrukning säger och inte säger om ATP.

Färgämnet tillförde mest där cellerna respirerade minst

Mogna erytrocyter från däggdjur har nästan ingen mätbar syreförbrukning. Kärnförsedda fågelerytrocyter har det. Harrop och Barron undersökte båda, och kontrasten är ryggraden i deras resonemang.

I däggdjursproverna gav färgämnet tjugo- till femtiofaldiga ökningar. I gåsblod, vars celler redan respirerade, mer än fördubblade det aldrig hastigheten. Ju högre den ursprungliga respirationen var, desto mindre kunde färgämnet tillföra.

Samma gradient syns inom en och samma art. Ett människoblodprov från en patient med polycytemia vera, som innehöll omogna celler, förbrukade 11.3 procent av sitt syre utan färgämne, jämfört med 2.8 procent för tvättade celler från en frisk givare. Färgämnet höjde värdet bara till 63.4 procent, en sexfaldig ökning där normala celler ökade nästan trettiofaldigt. Färgämnet fick mogna celler att bete sig mer som omogna, vilket var vad författarna sade att det gjorde.

Cyanid borde ha stoppat det

Det var känt att cyanid stoppade cellulär oxidation. Harrop och Barron tillsatte det ändå, tillsammans med färgämnet.

Resultaten från nötkreatursblod är representativa. Syreinnehållet sjönk från 22.61 till 22.03 volymprocent under tre timmar utan tillsatser. Med metylenblått sjönk det till 12.84. Med metylenblått och kaliumcyanid i en koncentration av en femtusendels molar sjönk det till 12.74. Färgämnets effekt var i stort sett opåverkad.

Figur: en kontinuerlig mikrorespirationsregistrering av mänskliga erytrocyter. Pilen markerar tillsatsen av metylenblått. Före den är kurvan nästan plan; därefter stiger den stadigt. Återgiven från Harrop och Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Deras slutsats var att färgämnet fungerade som en syrebärare och ”tillförde ett ämne som har försvunnit från vuxna däggdjurs kärnlösa erytrocyter”. Två år senare formulerade Michaelis och Salomon vid Rockefeller Institute motsättningen på ett sätt som har bestått. Antingen var färgämnets effekt ”en tillfällig egenskap hos färgämnet”, eller så var färgämnet ”en modell för något okänt ämne i organismerna”. Den frågan är fortfarande öppen. Det som har förändrats är att cellerna nu kan beskrivas mycket mer exakt.

Ett leverextrakt gjorde samma sak

Michaelis och Salomon visade att kallvattenextrakt från organ gav samma stimulering. Råttlever var starkast, följd av njure, mjälte och testikel. Hjärna, muskel och blodserum hade liten eller ingen effekt.

De testade sedan extraktet mot kolmonoxid. Respiration som framkallats av antingen extraktet eller färgämnet var oförändrad i en blandning av 98 procent kolmonoxid och 2 procent syre. Samma gasblandning hämmade respirationen hos jäst och kärnförsedda hönserytrocyter med ungefär 60 till 80 procent, i linje med Warburgs beskrivning av ett kolmonoxidkänsligt respirationsferment. Det oidentifierade vävnadsämnet var alltså inte Warburgs enzym.

Flera tänkbara kandidater föll bort längs vägen. Reducerat glutation och cystein gav bara den syreförbrukning som krävdes för deras egen oxidation. Harden och Youngs koenzym uteslöts eftersom muskel innehåller mest av det men uppvisade nästan minst effekt. Keilins cytokrom, som hade fått sitt namn några år tidigare, stötte på samma motsägelse. Sin egen tanke, att det aktiva ämnet kom från cellkärnan, kallade de ett rent förslag.

Effekten var villkorad

Cellerna måste vara intakta. Hemolys genom destillerat vatten eller upprepad frysning upphävde responsen på både färgämnet och extraktet, och partiell hemolys minskade den proportionellt.

Socker krävdes också. Glukos, fruktos och sackaros möjliggjorde den färgämnesinducerade respirationen; mannitol gjorde det inte. Utan socker förekom ingen respiration alls, och färgämnet tycktes skada cellerna under processen, så glukos som tillsattes en eller två timmar senare återställde den inte. Författarna föreslog att färgämnet oxiderade en strukturell komponent som cellen behövde.

Belysning ökade färgämnets effekt avsevärt, även om effekten var tydlig i mörker. Andra reducerbara färgämnen betedde sig annorlunda: toluylenblått motsvarade eller överträffade metylenblått, medan indigodisulfonat nästan inte gjorde någonting. Inget tydligt samband framträdde mellan ett färgämnes oxidations-reduktionspotential och effektens storlek, vilket författarna tillskrev membranpermeabilitet och toxicitet.

Effekten följde jäsningen, inte respirationen

Barrons studie från 1930 gick från cellsuspensioner till vävnadssnitt av normala råttorgan och transplanterade tumörer.

I vävnader utan aerob glykolys gjorde metylenblått ingenting eller minskade syreförbrukningen något: i njure med omkring 14 procent, i bukspottkörtel med omkring 14 procent och i lever med omkring 5 procent. I vävnader som jäser i närvaro av syre ökade det förbrukningen: i mjälte med omkring 8 procent och i hjärna med omkring 13 procent. Ökningarna i tumörer varierade från omkring 27 procent i ett mänskligt bröstkarcinom till mer än 80 procent i ett Rous-sarkom hos kyckling, ungefär i proportion till varje vävnads aeroba glykolys.

Figur: varje punkt är en vävnadstyp. Den horisontella axeln visar aerob glykolys; den vertikala axeln visar förändringen i syreförbrukning efter metylenblått. Data från Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), tabell 6, PMID 19869777.

Cyanidexperimentet gav sedan spegelbilden. När respirationen i dessa tidigare icke-responsiva vävnader blockerades med cyanid och jäsningen framträdde ökade färgämnet åter syreförbrukningen: i njure med omkring 59 procent, i lever med omkring 19 procent, i mjälte med omkring 286 procent och i testikel med omkring 200 procent.

Barron föreslog att färgämnet kunde användas för att testa en cells eller vävnads jäsningsförmåga och avslutade med en spekulation: generationer av tumörodling i färgämneshaltigt medium skulle en dag kunna göra en tumörs ämnesomsättning permanent lik den hos normal vävnad. Det var en forskningsfråga formulerad 1930. Det är inte ett påstående om behandling.

Vad experimenten inte kan ha mätt

År 1928 och 1930 betydde ”respiration” syreförbrukning. Adenosintrifosfat rapporterades första gången 1929, och demonstrationen av att isolerade mitokondrier förestrar fosfat samtidigt som de överför elektroner kom 1949. Ingen av de tidiga artiklarna om metylenblått kan ha mätt energiproduktion, och ingen av dem påstod det.

Cellerna är det andra problemet. Mogna erytrocyter från däggdjur innehåller inga mitokondrier. Under retikulocytstadiet avlägsnar de mitokondrier och ribosomer genom selektiv autofagi, vilket är anledningen till att en mogen röd blodkropp drivs av glykolys och är beroende av sin pentosfosfatväg främst för NADPH snarare än för ATP. I experimenten från 1928 fanns ingen elektrontransportkedja att reparera. Det som förbrukade syret gjorde något annat.

Vad detta andra var är numera ganska väl beskrivet. Metylenblått tar emot elektroner från cellulära reduktionsekvivalenter och blir leukometylenblått, som återoxideras av molekylärt syre och därmed sluter cykeln. I mänskliga röda blodkroppar utför NADPH-beroende flavinreduktas och närbesläktade disulfidreduktaser reduktionssteget. En studie från 1976 med märkt glukos fann att färgämnet stimulerar hexosmonofosfatshunten, att effekten vid låg koncentration var beroende av oxyhemoglobin och att en högre koncentration, 0.1 mM, bildade väteperoxid. Ett reducerat färgämne som möter syre bildar peroxid, inte fosfatbindningar.

I mitokondrier är bilden mer omstridd än de populära sammanfattningarna medger. En forskningsinriktning hävdar att färgämnet tar elektroner från området kring komplex I och lämnar dem till cytokrom c. En annan fann att det i mitokondrier från mushjärna inte kan återställa respirationen efter en antimycinblockad och placerade i stället elektronacceptorn vid komplex III:s ubikinolbindningsställe. En tredje fann att låga koncentrationer ökade syreförbrukningen i vila medan ADP-stimulerad respiration förblev oförändrad. Det mest direkta uttrycket för poängen är att metylenblåttinducerad syreförbrukning inte alls är beroende av oxidativ fosforylering: den kvarstod när respirationskedjan hämmades och i preparat som saknade en sådan.

Det finns också direkta mätningar av skillnaden mellan de två storheterna. I isolerade mitokondrier från råttlever sänkte ökande färgämneskoncentrationer de respiratoriska kontrollkvoterna och orsakade svullnad, vilket författarna beskrev som frikoppling av oxidativ fosforylering. I perfunderad råttlever ökade metylenblått syreförbrukningen samtidigt som ATP/ADP-kvoten sjönk.

Den kliniska dokumentationen förmedlar samma budskap. Methemoglobinemi behandlas med ungefär ett till två milligram metylenblått per kilogram intravenöst, via en NADPH-beroende reduktionsväg, och större doser orsakar det tillstånd som behandlas. Samma översikt konstaterar att antidoteffekten är störst i intakta erytrocyter och minskar när hemolys förekommer, vilket är hemolysfyndet från 1930 som återkommer sjuttiotre år senare i sjukhusmiljö. En förening vars gynnsamma och skadliga effekter ligger på var sin sida om en doströskel är inte en förening vars dos bör härledas ur en mätning av syreförbrukning.

Varför tillverkningssatsen hör till diskussionen

Harrop och Barron noterade något som är värt en andra läsning. Metylenblått självt ger ett band i spektroskopet mellan methemoglobinets två karakteristiska band, ”vilket lätt kan orsaka förväxling vid en hastig granskning”. Färgämnet kan efterlikna det ämne man letar efter.

Samma problem har en kemisk form. En närbesläktad fenotiazin som förekommer som en mindre beståndsdel har sitt eget redoxbeteende, sin egen permeabilitet och sin egen toxicitet. Ett dokumenterat fall gör betydelsen konkret: i en studie av jodering av metylenblått gav prover som innehöll ungefär 7 till 8 procent Azure B främst joderat Azure B, så föroreningen snarare än metylenblåttet dominerade reaktionen.

Den som använder metylenblått som reagens, i ett laboratorium, vid en färgningsbänk eller i ett akvarium, arbetar med en ospecificerad ingrediens om inte tillverkningssatsen har karakteriserats. Närbesläktade ämnen, identitet, elementära föroreningar, kvarvarande lösningsmedel och glödgningsrest är en del av experimentet snarare än pappersarbete runt det. Blupreme hämtar sitt metylenblått från en läkemedelstillverkare och publicerar ett fullständigt analyscertifikat, med tester av hela USP-specifikationen snarare än enbart tungmetaller; guiden till att läsa ett analyscertifikat och vad beteckningen USP-kvalitet fastställer och inte fastställer beskriver hur dokumentet kan kontrolleras mot påståendet.

Siffran var rätt

Experimenten från 1928 och 1930 var omsorgsfulla, och deras centrala observation har bestått: ett reducerbart färgämne kan få en cell som knappt respirerar att förbruka syre med många gånger sin hastighet i vila, utan att passera det steg som cyanid blockerar.

Misstaget uppstår senare, när ”respiration” läses i sin moderna betydelse. En mätning av gasutbyte säger att elektroner nådde syre. Den säger inte att någon av dem användes för att bilda ATP, och i en cell utan mitokondrier är avståndet mellan dessa två påståenden så stort som det kan bli. Den bredare kartläggningen av vad metylenblått gör i celler sätter samma åtskillnad i ett vidare sammanhang, och föreningens historia från färgämne till läkemedel förklarar hur ett textilfärgämne över huvud taget hamnade i dessa experiment.