Kako metilensko plavo ulazi u ćelije: redukcija, reoksidacija, unos

Posmatrajte kako endotelne ćelije u posudi preuzimaju metilensko plavo i najviše će se nametnuti upravo pogrešno tumačenje. Medijum gubi plavu boju, u ćelijama se pojavljuju plave granule, pa je boja sigurno prošla kroz membranu kao plavi molekul. Eksperimenti pokazuju drugačije. Plavi oblik jedva prolazi kroz membranu. Prolazi bezbojni oblik, a plava boja koju vidite unutra nastaje tek unutar ćelije, nakon ulaska.

Taj obrnuti sled je važan jer određuje šta bojenje može, a šta ne može da pokaže. Plave granule ukazuju na oksidovanu boju koja je ponovo oksidovana i zadržana u organelama. One ne pokazuju ukupnu količinu boje u ćeliji, ne pokazuju količinu redukovanog oblika i ne mere biološki efekat. Da biste razumeli zašto, pratite tri koraka: redukciju na površini, difuziju redukovanog oblika, pa reoksidaciju i zadržavanje unutar ćelije.

Dva oblika se ponašaju kao različiti molekuli

Oksidovano metilensko plavo je planarni prstenasti sistem s pozitivnim naelektrisanjem. Rastvara se u vodi, snažno apsorbuje svetlost u opsegu od oko 600 do 700 nanometara i izgleda plavo. Naelektrisanje je ključno. Naelektrisan, hidrofilan molekul ne prolazi lako kroz lipidnu membranu, pa se u literaturi pažljivo opisuje kao relativno nepropustan kroz membranu, a ne kao nepropustan.

Redukovano metilensko plavo, koje se naziva leukometilensko plavo, bezbojno je, nenaelektrisano i rastvorljivo u mastima. Uklanjanjem naelektrisanja membrana prestaje da bude zid. Redukovani molekul lako prolazi difuzijom, a kada dospe u odeljak s većom oksidujućom sposobnošću, može ponovo da izgubi elektrone i vrati se u plavi, naelektrisani oblik koji ostaje zarobljen. Zato je redoks hemija boje ujedno i njen mehanizam transporta. Promenite broj elektrona i promenićete propustljivost.

Elektroni za prvi korak potiču iz same ćelije. Ćelije sisara prenose elektrone kroz plazma membranu, premeštajući redukcione ekvivalente od unutarćelijskih donora ka akceptorima na površini. Ova aktivnost prenosa kroz plazma membranu normalna je ćelijska funkcija, prisutna u većini tipova ćelija, a reduktaza na površini endotelnih ćelija koja redukuje tiazinske boje ponaša se kao druge reduktaze u jednom važnom pogledu: nastavlja da radi u prisustvu cijanida i azida u dozama koje zaustavljaju kasnije korake. Ta razlika je ključ cele priče.

Raspodela između faza bila je prvo objašnjenje i gotovo je objasnila unos

Godine 1929, Marian Irwin sa Instituta Rockefeller postavila je jednostavnije pitanje. Možda je ulazak boje samo raspodela između vode i masnih slojeva ćelije, a sloj hloroforma može u laboratoriji da posluži kao zamena za te masne slojeve. U svojim spektrofotometrijskim istraživanjima prodiranja mućkala je vodene rastvore boje s hloroformom i upoređivala ono što je prešlo u organsku fazu s onim što je ušlo u žive ćelije algi.

Dva nalaza iz tog rada i dalje zaslužuju pažnju. Prvo, komercijalni rastvori metilenskog plavog sadržali su trimetiltionin, koji se danas naziva Azure B, a ta nečistoća prodirala je brže od samog metilenskog plavog, naročito pri alkalnom pH, kada preovlađuje oblik slobodne baze rastvorljiv u lipidima. Deo onoga što je izgledalo kao ulazak metilenskog plavog zapravo je bio selektivan ulazak Azure B. Drugo, pH je određivao ishod time što je određivao stanje jonizacije, a oštećene ćelije propuštale su daleko više boje od neoštećenih. Koeficijenti raspodele i stanje naelektrisanja određivali su šta apsorbuju i veštački sistem i živa ćelija, a sličnost između njih podržavala je ideju o nevodenim slojevima na ćelijskoj granici.

Model je dalekovido ukazao na značaj lipida i jonizacije, ali nije mogao da razlikuje boju koja se raspodeljuje u svom postojećem obliku od boje koja se hemijski menja na površini, prelazi u izmenjenom obliku, pa se unutar ćelije vraća u prvobitni oblik. Za tu razliku bio je potreban drugačiji eksperiment, koji je usledio sedamdeset godina kasnije na plućnom endotelu.

Redukcija spolja, zadržavanje unutra

Merker i saradnici radili su s gajenim endotelnim ćelijama goveđe plućne arterije i predložili sled od tri koraka: oksidovana boja se na površini ćelije redukuje u svoj bezbojni lipofilni oblik, redukovani oblik ulazi difuzijom, a unutarćelijska reoksidacija ponovo stvara oksidovani oblik koji ne prolazi kroz membranu i zato se nakuplja. Zatim su u svom istraživanju unosa tiazinskih boja u endotelne ćelije proverili taj sled pokušavajući da ga prekinu na određenim mestima.

Prvo sredstvo bio je fericijanid, akceptor elektrona koji ne može da uđe u ćeliju. Kada površinski enzimi redukuju plavu boju u njen bezbojni oblik izvan ćelije, fericijanid može da preuzme te elektrone i ponovo stvori plavu boju u medijumu pre nego što ona uopšte prođe kroz membranu. Dokle god je fericijanid bio prisutan u višku (10 mikromolara boje naspram 50 do 500 mikromolara fericijanida), unos boje gotovo je prestajao, a tek nakon što bi fericijanid bio potrošen, unos bi se nastavio uobičajenom brzinom. Kinetika je na drugi način pokazala isto. Fericijanid je nestajao približno konstantnom brzinom, što odgovara stalnom toku površinske redukcije koji snabdeva posrednika koji se može ponovo koristiti, dok je vanćelijska boja nestajala eksponencijalno kako se njena raspoloživa količina smanjivala. Konstantan tok uz opadajuću količinu boje znači da signal fericijanida odražava neprekidnu redukciju, a ne izlazak molekula boje iz rastvora.

Drugo sredstvo potpuno je uklonilo korak prolaska kroz membranu. Tim je vezao toluidinsko plavo O, blisko srodnu tiazinsku boju, za veliki poliakrilamidni lanac, prevelik da uđe u ćeliju u bilo kom oksidacionom stanju. Ćelije su i dalje redukovale vezanu boju. Redukcija, dakle, ne zahteva pristup unutrašnjosti ćelije. Mehanizam je izložen na površini ili je električno povezan s njom.

Zatim je došlo razdvajanje procesa po kojem je rad dobio naslov. Cijanid i azid pri koncentraciji od 2 milimolara snažno su potisnuli nakupljanje boje, a pod mikroskopom su tamnoplave i ljubičaste inkluzije, koje obično okružuju jedro, gotovo nestale. Ipak, nijedan inhibitor nije usporio vanćelijsku redukciju: ciklične reakcije fericijanida nastavile su se nesmanjenim intenzitetom, a polimer koji ne prolazi kroz membranu i dalje je bio redukovan. Blokada je bila u kasnijem koraku. Cijanid i azid zaustavljali su unutarćelijsku reoksidaciju i zadržavanje, a ne površinsku redukciju. Kontrole vijabilnosti podržale su ovo tumačenje, jer su ćelije tokom tih tretmana zadržale svoj citosolni markerski enzim, laktat-dehidrogenazu, pa gubitak unosa nije bio samo posledica trovanja ili pucanja membrane.

Jedna napomena iz rada i dalje važi. Plave inkluzije nalazile su se oko jedra, ali ne u njemu, što je u skladu s oksidacijom unutar subćelijskih organela, ali istraživanje nije utvrdilo kojih. Slični obrasci u drugim tipovima ćelija proglašavani su lizozomskim na osnovu oskudnih dokaza. Zadržavanje smatrajte potvrđenim, a njegovu tačnu lokaciju privremenim zaključkom. Čitaoci koji prate kuda elektroni dalje odlaze mogu da nastave s temom mitohondrijskog transporta elektrona i redoks procesa i širom slikom apsorpcije i distribucije prema putu primene.

Bojenje nije izloženost

Treće istraživanje pokazuje šta se dešava kada se ovaj mehanizam unosa poveže s merenjem biološkog odgovora. Scott i saradnici utvrdili su da metil-beta-ciklodekstrin, šećer u obliku prstenastog torusa, direktno vezuje metilensko plavo, uz konstantu asocijacije inkluzionog kompleksa od oko 310 po molaru, naspram oko 5846 po molaru za dimerizaciju boje. U fibroblastima L929 ovo vezivanje blokiralo je i bojenje ćelija i stimulaciju unosa glukoze: prethodna inkubacija s ciklodekstrinom sprečavala je plavo bojenje, a njegovo naknadno dodavanje ubrzavalo je gubitak boje. Kako je optički signal plave boje nestajao iz ćelija, pojačani transport glukoze opadao je gotovo uporedo s njim.

Autori su ovu korelaciju protumačili kao nalaz koji više podržava direktnu interakciju boje s nekim proteinom u putu aktivacije transportera glukoze nego dugotrajan mehanizam oksidativnog stresa. Taj zaključak je razuman, ali ima ograničenja. Eksperiment ne identifikuje protein, ne pokazuje vezivanje za sam transporter, a korelacija između gubitka boje i nestanka efekta ne može da isključi svaki put posredovan redoks procesima.

Trajna pouka odnosi se na merenje. Optičko bojenje pokazuje vidljivu, oksidovanu boju povezanu s ćelijom. Bezbojni redukovani oblik potpuno izmiče tom merenju, pa slabo obojena ćelija i dalje može da sadrži ekvivalente boje, dok intenzivno obojena ćelija ukazuje na zadržanu oksidovanu boju, a ne na ukupnu izloženost tkiva ili veličinu efekta. Ista opreznost potrebna je i na većoj skali: poređenje bojenja različitih tipova ćelija ili tumačenje tamnog preseka tkiva kao dokaza veće izloženosti ponavlja prvobitnu grešku u posudi. Unos je ciklus redukcije, difuzije i reoksidacije, a svaki pojedinačni snimak plavog oblika prikazuje samo jedan deo tog ciklusa. Praktične posledice za laboratorijsko bojenje i rukovanje i za tumačenje tvrdnji o dozi i izloženosti proizlaze direktno iz toga.