Bojenje metilenskim plavim: mikroskopske metode i atlas stvarnih snimaka

Bojenje metilenskim plavim olakšava razlikovanje inače slabo vidljivih ćelijskih struktura pri mikroskopiji u svetlom polju. Može pomoći učenicima da pronađu jedro ćelije sluzokože obraza ili ispitaju konture i raspored mikroorganizama. Međutim, plavi objekat je samo opažanje. Imenovanje organizma, njegovo merenje i procena da li ukazuje na bolest zasebni su zadaci.

Naslovna slika ilustruje princip kontrasta. Atlas u nastavku sadrži stvarne fotografije nezavisno dokumentovanih uzoraka, uz izvorne podatke o njihovom poreklu.

Šta metilensko plavo otkriva?

Metilensko plavo je bazna boja: njen obojeni jon nosi pozitivno naelektrisanje. Kao što OpenStax objašnjava u prikazu bojenja uzoraka, bazne boje stupaju u interakciju sa negativno naelektrisanim ćelijskim materijalom i mogu učiniti ćelije uočljivijim na svetlijoj pozadini. U odgovarajućim preparatima metilensko plavo ističe oblasti bogate nukleinskim kiselinama i druge strukture koje vezuju boju.

Pri jednostavnom bojenju jedna boja obezbeđuje kontrast. Zbog toga različiti organizmi mogu izgledati plavo, a da nisu isti organizam. Korisna pitanja su u početku opisna: da li su objekti okrugli ili izduženi, izdvojeni ili grupisani, ravnomerno obojeni ili sa uočljivim unutrašnjim razlikama? Pogledajte razliku između jednostavnog bojenja i bojenja po Gramu pre nego što boju protumačite kao rezultat klasifikacije.

Kontrast i rezolucija nisu isto. Kontrast pomaže da se objekat razlikuje od okoline; rezolucija omogućava razdvajanje bliskih detalja. Tamnija slika ne garantuje da će više struktura biti jasno razlučeno. Niti svaku tamnu granulu treba označiti kao organelu.

Nativni preparati, obojeni mokri preparati i razmazi

Neobojeni, odnosno nativni, mokri preparat omogućava posmatranje bez dodate boje, iako izdvajanje iz izvornog okruženja ipak menja uzorak. Kod obojenog mokrog preparata reagens se dodaje dok materijal ostaje u tečnosti ispod pokrovnog stakla. Kod fiksiranog razmaza materijal se razmazuje po predmetnom staklu i primenjuje se određena metoda fiksacije pre dalje obrade. OpenStax pregled pripreme preparata razlikuje mokre preparate od fiksacije i objašnjava zašto fiksirani organizmi više ne omogućavaju uvid u normalno kretanje ili metabolizam.

Ovi preparati odgovaraju na različita pitanja:

Za poređenje u nastavi, zabeležite neobojeni preparat pre posmatranja zasebnog obojenog preparata napravljenog prema nastavnom protokolu. Održavajte uporediva podešavanja osvetljenja i snimanja. Ako fotografišete dve različite ćelije, opišite ih kao primere, a ne kao zapis jedne ćelije pre i posle bojenja.

Mikroskopski atlas: tri stvarna obojena uzorka

Ovaj atlas predstavlja originalni izbor i tumačenje tri mikrofotografije sa otvorenim licencama. Autori izvora navode identitet uzoraka i korišćene boje. Nismo nezavisno potvrdili identitet njihovih uzoraka. Slike su reprodukovane bez izrezivanja, konverzijom u WebP bez gubitaka, bez dodavanja elemenata ili promene boja.

Tabla 1: ljudske ćelije sluzokože obraza

Uzorak: ljudske ćelije sluzokože obraza. Boja: metilensko plavo. Uvećanje: 400×, prema navodu fotografa. Razmerna crta: nije dostupna; izvor ne navodi kalibrisanu veličinu piksela. Fotografija autora Fritzmann2002, 2017, iz izvora Ljudske ćelije sluzokože obraza (bojenje metilenskim plavim), pod licencom CC BY-SA 4.0. Ova reprodukcija zadržava tu licencu.

Počnite od izdvojene ćelije: njeno tamnije jedro lakše se razlikuje od okolne plave citoplazme. Zatim pregledajte ćelije koje se preklapaju ispod nje. Preklapanje otežava praćenje granice i može stvoriti lokalno tamniju oblast. Koristite ovu tablu za vežbanje praćenja kontura, a ne za brojanje svake tamne mrlje kao jedra. Vodič za posmatranje ćelija sluzokože obraza razrađuje vežbu prilagođenu ovom uzorku.

Tabla 2: ćelije crnog luka

Uzorak: ćelije crnog luka, prema identifikaciji u izvoru. Boja: metilensko plavo. Uvećanje: „200x” se pojavljuje u izvornom nazivu datoteke; nije nezavisno potvrđeno. Razmerna crta: nije dostupna; kalibracija nije navedena. Fotografija autora Alvy16, 2019, iz izvora Ćelija crnog luka 200x, pod licencom CC BY 4.0.

Izduženi odeljci formiraju pravilno organizovan sloj. Uporedite njihove duge zajedničke granice sa nepravilnim konturama na Tabli 1. Uočite i izrazito taman materijal i neravnomernu svetlinu vidnog polja. Fotografija ne utvrđuje identitet svake tamne naslage. Ona pokazuje zašto koristan zapis opažanja uključuje artefakte i neizvesnost, umesto da označava sve što se oboji.

Tabla 3: kvasci koje izvor identifikuje kao Candida spp.

Uzorak: Candida spp., prema navodu fotografa. Boja: jednostavno pozitivno bojenje metilenskim plavim. Uvećanje: nije dostupno. Razmerna crta: nije dostupna; kalibrisana veličina piksela nije navedena. Fotografija Marte, korisnice Vikimedije Martunia.g, 2021, iz izvora Pozitivno bojenje metilenskim plavim 2, pod licencom CC BY 4.0.

Uporedite guste plave skupine sa manje zbijenim rubnim oblastima. Pojedinačne konture lakše je pratiti tamo gde se objekti manje preklapaju. Naziv Candida potiče iz izvornog zapisa, a ne iz identifikacije vrste izvedene na osnovu ove fotografije. Ova tabla takođe ne daje rezultat procene vijabilnosti. Testovi vijabilnosti i respiracije kvasaca zahtevaju sopstvene uslove, kontrole i tumačenje.

Pravilno tumačenje razmere

Ove table omogućavaju vizuelno poređenje, a ne merenja u mikrometrima ili poređenja apsolutne veličine ćelija između tabli. Navedeno uvećanje ne može nadoknaditi nedostajuću kalibraciju kamere. Promena veličine prikaza slike menja njeno prividno uvećanje.

Za sopstvene slike, uspostavite mernu kalibraciju pomoću poznatog etalona i odgovarajuće optičke postavke. Nikon vodič za mikrometriju objašnjava kako objektni mikrometar pretvara proizvoljne podeoke na slici ili okularnoj skali u fizičke dužine. Zabeležite objektiv, konfiguraciju kamere i kalibraciju, pa dodajte razmernu crtu na osnovu tih podataka. Nemojte je određivati prema prosečnoj veličini ćelije iz udžbenika.

Da li sadržaj bočice odgovara metodi?

Bočica označena kao metilensko plavo ne predstavlja potpunu laboratorijsku specifikaciju. Proverite koncentraciju i jedinice, rastvarač, dodatne sastojke, predviđenu primenu, dokumentaciju serije i uputstva. Bezbednosni list reagensa opisuje opasnosti; uputstva za metodu određuju kako se on koristi za predviđeni preparat.

Konkretan primer je Merck Löfflerov rastvor metilenskog plavog. Proizvođač ga navodi kao reagens za mikroskopiju i opisuje njegovu ulogu kao kontrastne boje pri bojenju acidorezistentnih mikroorganizama. Navedena zapaljivost takođe pokazuje zašto „plava tečnost” nije dovoljna informacija za planiranje rukovanja ili zagrevanja. Ta svojstva važe za tu formulaciju, a ne automatski za svaki vodeni rastvor metilenskog plavog.

Isto tako, eozin-metilensko plavo agar predstavlja formulisanu hranljivu podlogu. Nije boja za mikroskopske preparate koja se dobija dodavanjem samog metilenskog plavog uzorku. Za drugačiji cilj snimanja, uporedite alternative metilenskom plavom za mikroskopiju.

Kod početničkog kompleta za mikroskopiju, počnite od dokumentovane nastavne metode, poznatih gotovih preparata i propisanog reagensa. Ako je bočica izgubila etiketu ili njen sastav ne može da se utvrdi, zamenite je odgovarajućim reagensom sa dokumentacijom. Koristite zaštitu za oči i uputstva za rukovanje koja se odnose na konkretnu formulaciju. Ljudski materijal i nepoznati uzorci iz okruženja zahtevaju primenu postupaka nastavne laboratorije za rukovanje uzorcima i njihovo odlaganje; bojenje nije zamena za te postupke.

Zapišite opažanje pre zaključka

„Plavi ovalni objekti u skupinama” jeste opis slike koji se može potkrepiti. „Određena infekcija” zahteva dokaze koje slika ne pruža. U laboratorijskoj beležnici odvojeno beležite poreklo uzorka, pripremu, reakciju bojenja i metodu identifikacije. Ta razlika čini jednostavnu nastavnu sliku korisnom i sprečava da se privlačnoj mikrofotografiji pripiše tvrdnja koju ona ne može da potkrepi.