Si hyn bluja e metilenit në qeliza: reduktimi, rioksidimi, marrja qelizore

Kur vëzhgoni një enë me qeliza endoteliale që marrin blu metileni, interpretimi më i dukshëm është edhe i gabuari. Mjedisi humbet ngjyrën blu, qelizat fitojnë granula blu, prandaj ngjyruesi duhet të ketë kaluar përmes membranës si molekulë blu. Eksperimentet tregojnë të kundërtën. Forma blu kalon me shumë vështirësi. Ajo që kalon është forma pa ngjyrë, ndërsa bluja që shihni brenda krijohet aty, pas hyrjes.

Ky përmbysim ka rëndësi sepse përcakton çfarë mund dhe çfarë nuk mund t'ju tregojë ngjyrosja. Granulat blu tregojnë ngjyrues të oksiduar, i cili është rioksiduar dhe është mbajtur në organele. Ato nuk tregojnë sasinë totale të ngjyruesit në qelizë, nuk tregojnë rezervën e reduktuar dhe nuk matin efektin biologjik. Për të kuptuar arsyen, ndiqni tre hapat: reduktimin në sipërfaqe, difuzionin e formës së reduktuar, rioksidimin dhe mbajtjen brenda.

Dy format sillen si molekula të ndryshme

Bluja e metilenit e oksiduar është një sistem unazash i sheshtë, me ngarkesë pozitive. Ajo tretet në ujë, përthith fort dritën rreth 600 deri në 700 nanometra dhe duket blu. Çelësi është ngarkesa. Një molekulë e ngarkuar dhe hidrofile nuk kalon lehtë përmes një membrane lipidike, ndaj formulimi i kujdesshëm në literaturë është relativisht e papërshkueshme për membranën, jo plotësisht e papërshkueshme.

Bluja e metilenit e reduktuar, e quajtur leukoblu metileni, është pa ngjyrë, pa ngarkesë dhe e tretshme në yndyrë. Hiqni ngarkesën dhe membrana pushon së qeni një mur. Molekula e reduktuar kalon lehtësisht me difuzion dhe, pasi hyn në një ndarje qelizore më oksiduese, mund të humbasë sërish elektrone dhe të kthehet në formën blu, të ngarkuar, që mbetet e bllokuar brenda. Prandaj, kimia redoks e ngjyruesit është edhe mekanizmi i tij i transportit. Ndryshoni numrin e elektroneve dhe ndryshoni përshkueshmërinë.

Elektronet për hapin e parë vijnë nga vetë qeliza. Qelizat e gjitarëve kryejnë transport elektronesh përmes membranës plazmatike, duke zhvendosur ekuivalentë reduktues nga dhuruesit brendaqelizorë drejt pranuesve në sipërfaqe. Ky aktivitet përmes membranës plazmatike është një funksion normal qelizor, i pranishëm në shumicën e llojeve të qelizave. Reduktaza në sipërfaqen endoteliale që vepron mbi ngjyruesit tiazinikë sillet si reduktazat e tjera në një aspekt domethënës: vazhdon të punojë në prani të cianurit dhe azidit në doza që ndalojnë hapat e mëvonshëm. Ky dallim është pika kyçe e gjithë shpjegimit.

Shpërndarja ndërmjet fazave erdhi e para dhe pothuajse e shpjegoi marrjen qelizore

Në 1929, Marian Irwin në Institutin Rockefeller shtroi një pyetje më të thjeshtë. Ndoshta hyrja e ngjyruesit është thjesht shpërndarje ndërmjet ujit dhe shtresave yndyrore të qelizës, dhe një shtresë kloroformi mund t'i përfaqësojë ato shtresa yndyrore në laborator. Në studimet e saj spektrofotometrike të depërtimit, ajo tundi tretësira ujore të ngjyruesit me kloroform dhe krahasoi atë që kalonte në fazën organike me atë që hynte në qelizat e gjalla të algave.

Dy gjetje nga ajo punë ende meritojnë vëmendje. Së pari, tretësirat tregtare të blusë së metilenit përmbanin trimetiltioninë, që sot quhet azure B, dhe kjo papastërti depërtonte më shpejt se vetë bluja e metilenit, sidomos në pH alkalin, ku mbizotëron forma e bazës së lirë, e tretshme në lipide. Një pjesë e asaj që dukej si hyrje e blusë së metilenit ishte në të vërtetë hyrje përzgjedhëse e azure B. Së dyti, pH-ja përcaktonte rezultatin duke përcaktuar gjendjen e jonizimit, dhe qelizat e dëmtuara lejonin hyrjen e shumë më tepër ngjyruesi sesa qelizat e paprekura. Koeficientët e shpërndarjes dhe gjendja e ngarkesës përcaktonin atë që përthithnin si sistemi artificial, ashtu edhe qeliza e gjallë, dhe ngjashmëria ndërmjet tyre mbështeste idenë e shtresave joujore në kufirin qelizor.

Modeli parashikonte saktë rolin e lipideve dhe të jonizimit, por nuk mund të dallonte një ngjyrues që shpërndahet ndërmjet fazave në formën e vet nga një ngjyrues që shndërrohet kimikisht në sipërfaqe, kalon në një formë tjetër dhe rikthehet në formën fillestare brenda. Për këtë dallim nevojitej një eksperiment tjetër, i cili erdhi shtatëdhjetë vjet më vonë në endotelin pulmonar.

Reduktim jashtë, mbajtje brenda

Merker dhe kolegët punuan me qeliza endoteliale të kultivuara nga arteriet pulmonare të gjedhëve dhe propozuan një sekuencë me tre hapa: ngjyruesi i oksiduar reduktohet në sipërfaqen qelizore në formën e tij lipofile pa ngjyrë, forma e reduktuar hyn me difuzion dhe rioksidimi brendaqelizor rigjeneron formën e oksiduar që nuk përshkon membranën dhe që grumbullohet. Më pas, studimi i tyre mbi marrjen endoteliale të ngjyruesve tiazinikë e testoi këtë sekuencë duke u përpjekur ta ndërpriste në pika të caktuara.

Mjeti i parë ishte ferricianuri, një pranues elektronesh që nuk mund të hyjë në qelizë. Kur enzimat sipërfaqësore e reduktojnë ngjyruesin blu në formën e tij pa ngjyrë jashtë qelizës, ferricianuri mund t'ia marrë sërish ato elektrone, duke rigjeneruar ngjyruesin blu në mjedis përpara se ai të kalojë membranën. Për sa kohë ferricianuri ishte i pranishëm në tepricë (10 mikromolar ngjyrues kundrejt 50 deri në 500 mikromolar ferricianur), marrja e ngjyruesit pothuajse ndalonte; vetëm pasi konsumohej ferricianuri, marrja rifillonte me shpejtësinë e saj normale. Kinetika e tregoi të njëjtën gjë në një mënyrë të dytë. Ferricianuri zhdukej me një shpejtësi afërsisht konstante, në përputhje me një fluks të qëndrueshëm reduktimi në sipërfaqe që furnizonte një ndërmjetës të riciklueshëm, ndërsa ngjyruesi jashtëqelizor zhdukej në mënyrë eksponenciale teksa shterohej rezerva e tij. Një fluks konstant së bashku me një rezervë që shterohet do të thotë se sinjali i ferricianurit tregon reduktim të vazhdueshëm, jo largimin e molekulave të ngjyruesit nga tretësira.

Mjeti i dytë e hoqi krejtësisht hapin e kalimit. Grupi lidhi blunë e toluidinës O, një ngjyrues tiazinik të afërt, me një zinxhir të madh poliakrilamidi, tepër të madh për të hyrë në qelizë në cilëndo gjendje oksidimi. Qelizat përsëri e reduktonin ngjyruesin e lidhur. Prandaj, reduktimi nuk kërkon hyrje brenda qelizës. Aparati përgjegjës është i ekspozuar në sipërfaqe ose është i lidhur elektrikisht me të.

Pastaj erdhi dallimi që i jep punimit titullin. Cianuri dhe azidi në 2 milimolar e frenuan fort grumbullimin e ngjyruesit dhe, nën mikroskop, përfshirjet blu të errët dhe vjollcë që zakonisht rrethonin bërthamën pothuajse u zhdukën. Megjithatë, asnjëri frenues nuk e ngadalësoi reduktimin jashtëqelizor: ciklimi i ferricianurit vazhdoi pa u pakësuar dhe polimeri që nuk përshkonte membranën ende reduktohej. Bllokimi ndodhej në hapat pasues. Cianuri dhe azidi po ndalonin rioksidimin dhe sekuestrimin brendaqelizor, jo reduktimin sipërfaqësor. Kontrollet e qëndrueshmërisë jetësore e mbështetën këtë interpretim, pasi qelizat e ruajtën enzimën e tyre shënjuese citosolike, laktat dehidrogjenazën, gjatë këtyre trajtimeve. Pra, humbja e marrjes së ngjyruesit nuk ishte thjesht pasojë e helmimit ose e çarjes së membranës.

Një vërejtje kujdesi nga punimi mbetet e vlefshme. Përfshirjet blu ndodheshin rreth bërthamës, por jo brenda saj, në përputhje me oksidimin brenda organeleve nënqelizore, por studimi nuk identifikoi se cilat organele ishin. Modele të ngjashme në lloje të tjera qelizash ishin quajtur lizozomale mbi prova të dobëta. Konsiderojeni mbajtjen brenda si të vërtetuar, por vendndodhjen si paraprake. Lexuesit që ndjekin se ku shkojnë më tej elektronet mund të vazhdojnë te transporti mitokondrial i elektroneve dhe proceset redoks dhe te pamja më e gjerë e përthithjes dhe shpërndarjes sipas rrugës.

Ngjyrosja nuk është ekspozim

Një studim i tretë tregon çfarë ndodh kur kjo logjikë e marrjes qelizore lidhet me një tregues biologjik. Scott dhe kolegët zbuluan se metil-beta-ciklodekstrina, një sheqer me formë toroidale, lidhet drejtpërdrejt me blunë e metilenit, me një konstante asociimi rreth 310 për molar për kompleksin e përfshirjes, kundrejt rreth 5846 për molar për dimerizimin e ngjyruesit. Në fibroblastet L929, kjo lidhje bllokoi si ngjyrosjen qelizore, ashtu edhe stimulimin e marrjes së glukozës: inkubimi paraprak me ciklodekstrinën pengoi ngjyrosjen blu, ndërsa shtimi i saj më pas përshpejtoi çngjyrosjen. Ndërsa sinjali optik blu largohej nga qelizat, transporti i aktivizuar i glukozës zbehej në paralel të ngushtë me të.

Autorët e interpretuan këtë korrelacion si mbështetje për një ndërveprim të drejtpërdrejtë ndërmjet ngjyruesit dhe një proteine në rrugën e aktivizimit të transportuesit të glukozës, më shumë sesa për një mekanizëm afatgjatë të stresit oksidativ. Ky përfundim është i arsyeshëm, por ka kufij. Eksperimenti nuk e identifikon proteinën, nuk tregon lidhje me vetë transportuesin dhe korrelacioni ndërmjet çngjyrosjes dhe humbjes së efektit nuk mund të përjashtojë çdo rrugë të ndërmjetësuar nga proceset redoks.

Mësimi që mbetet i vlefshëm ka të bëjë me matjen. Ngjyrosja optike tregon ngjyruesin e dukshëm, të oksiduar dhe të lidhur me qelizat. Ajo nuk e kap aspak rezervën e reduktuar pa ngjyrë, ndaj një qelizë e zbehtë mund të përmbajë ende ekuivalentë ngjyruesi, ndërsa një qelizë e ngjyrosur fort tregon ngjyrues të oksiduar të mbajtur brenda, jo ekspozimin total të indit ose madhësinë e efektit. I njëjti kujdes vlen edhe në shkallë më të gjerë: krahasimi i ngjyrosjes ndërmjet llojeve të qelizave, ose trajtimi i një prerjeje indore të errët si provë e ekspozimit më të lartë, përsërit gabimin fillestar të vëzhgimit në enë. Marrja qelizore është një cikël reduktimi, difuzioni dhe rioksidimi, dhe çdo pamje e çastit e formës blu tregon vetëm një pjesë të tij. Pasojat praktike për ngjyrosjen dhe trajtimin në laborator dhe për interpretimin e pohimeve mbi dozën dhe ekspozimin rrjedhin drejtpërdrejt nga kjo.