Artikull
Ngjyrosja me blu metileni: metodat e mikroskopisë dhe një atlas me imazhe reale
Ngjyrosja me blu metileni i bën tiparet qelizore, që përndryshe duken zbehtë, më të lehta për t’u dalluar në mikroskopinë me fushë të ndritshme. Ajo mund t’i ndihmojë studentët të gjejnë bërthamën e një qelize të faqes ose të shqyrtojnë konturin dhe renditjen e mikroorganizmave. Megjithatë, një objekt blu është një vëzhgim. Emërtimi i organizmit, matja e tij dhe përcaktimi nëse tregon praninë e një sëmundjeje janë detyra më vete.
Imazhi i kopertinës ilustron parimin e kontrastit. Atlasi më poshtë përmban fotografi reale të mostrave të dokumentuara në mënyrë të pavarur, së bashku me informacionin e tyre burimor.
Çfarë zbulon bluja e metilenit?
Bluja e metilenit është një ngjyrues bazik: joni i saj me ngjyrë mbart një ngarkesë pozitive. Siç shpjegon OpenStax në trajtimin e ngjyrosjes së mostrave, ngjyruesit bazikë ndërveprojnë me materialin qelizor me ngarkesë negative dhe mund t’i bëjnë qelizat të dallohen mbi një sfond më të çelët. Në preparate të përshtatshme, bluja e metilenit nxjerr në pah rajonet e pasura me acide nukleike dhe struktura të tjera që lidhin ngjyruesin.
Në një ngjyrosje të thjeshtë, kontrasti sigurohet nga një ngjyrues i vetëm. Si rrjedhojë, organizma të ndryshëm mund të duken blu pa qenë i njëjti organizëm. Pyetjet e dobishme në fillim janë përshkruese: a janë objektet të rrumbullakëta apo të zgjatura, të veçuara apo të grumbulluara, të ngjyrosura njëtrajtësisht apo me dallime të brendshme? Shihni dallimin midis ngjyrosjes së thjeshtë dhe ngjyrosjes Gram përpara se ta interpretoni ngjyrën si rezultat klasifikimi.
Kontrasti dhe rezolucioni janë të ndryshëm. Kontrasti ndihmon në dallimin e një objekti nga mjedisi përreth; rezolucioni bën të mundur dallimin e detajeve pranë njëri-tjetrit. Një imazh më i errët nuk garanton më shumë struktura të dallueshme. Gjithashtu, jo çdo kokrrizë e errët duhet etiketuar si organelë.
Preparatet native, preparatet e lagështa të ngjyrosura dhe strishot
Një preparat i lagësht i pangjyrosur, ose nativ, ruan një pamje pa ngjyrues të shtuar, megjithëse largimi nga mjedisi fillestar e ndryshon gjithsesi mostrën. Në një preparat të lagësht të ngjyrosur shtohet reagjent ndërsa materiali mbetet në lëng nën një lamelë. Një strisho e fiksuar përgatitet duke shpërndarë materialin mbi një lamë dhe duke përdorur një metodë të përcaktuar fiksimi përpara përpunimit të mëtejshëm. Përmbledhja e OpenStax për përgatitjen e mostrave dallon preparatet e lagështa nga fiksimi dhe shpjegon pse organizmat e fiksuar nuk japin më një pamje të lëvizjes ose metabolizmit normal.
Këto preparate u përgjigjen pyetjeve të ndryshme:
| Preparati | Vëzhgimi i dobishëm | Çfarë nuk mund të përcaktojë vetëm imazhi |
|---|---|---|
| Preparat i lagësht nativ | Lëvizja, konturet, materiali i dukshëm pa ngjyrosje | Identitetin vetëm nga lëvizja ose forma |
| Preparat i lagësht i ngjyrosur | Kontrastin midis strukturave që lidhin ngjyruesin dhe mjedisit përreth | Nëse reagjenti e ka lënë të pandryshuar fiziologjinë normale |
| Strisho e fiksuar dhe e ngjyrosur | Morfologjinë e ruajtur pas një përgatitjeje të përcaktuar | Si sillej mostra fillestare e gjallë |
| Metodë diferenciale e emërtuar | Një reaksion ngjyrosjeje të përcaktuar me kontrolle të përshtatshme | Identitetin e species ose diagnozën pa provat më të gjera të metodës |
Për një krahasim në klasë, dokumentoni një preparat të pangjyrosur përpara se të shqyrtoni një preparat tjetër, të ngjyrosur sipas protokollit mësimor. Mbajini të krahasueshme ndriçimin dhe cilësimet e regjistrimit të imazhit. Nëse fotografoni dy qeliza të ndryshme, përshkruajini si shembuj, jo si një dokumentim para dhe pas ngjyrosjes së së njëjtës qelizë.
Atlas mikroskopie: tre mostra reale të ngjyrosura
Ky atlas është një përzgjedhje dhe interpretim origjinal i tre mikrofotografive me licenca të hapura. Autorët e burimeve identifikojnë mostrat dhe ngjyruesit. Ne nuk e kemi verifikuar në mënyrë të pavarur identitetin e mostrave të tyre. Imazhet janë riprodhuar pa prerje, si konvertime WebP pa humbje, pa shtuar elemente ose ndryshuar ngjyrat.
Figura 1: qeliza të faqes së njeriut
Mostra: qeliza të faqes së njeriut. Ngjyruesi: blu metileni. Zmadhimi: 400×, sipas fotografit. Shiriti i shkallës: nuk është i disponueshëm; burimi nuk jep madhësi të kalibruar të pikselit. Fotografi nga Fritzmann2002, 2017, nga Qeliza të faqes së njeriut (ngjyrosje me blu metileni), me licencë CC BY-SA 4.0. Ky riprodhim ruan të njëjtën licencë.
.jpg){kind=link}
Filloni me një qelizë të veçuar: bërthama e saj më e errët dallohet më lehtë nga citoplazma blu përreth. Më pas shqyrtoni qelizat e mbivendosura poshtë saj. Mbivendosja e bën më të vështirë ndjekjen e një kufiri dhe mund të krijojë një zonë lokalisht më të errët. Përdoreni këtë figurë për të ushtruar ndjekjen e kontureve, jo për të numëruar çdo njollë të errët si bërthamë. Udhëzuesi për vëzhgimin e qelizave të faqes e shtjellon ushtrimin për këtë lloj mostre.
Figura 2: qeliza të qepës
Mostra: qeliza të qepës, sipas identifikimit të burimit. Ngjyruesi: blu metileni. Zmadhimi: “200x” shfaqet në emrin origjinal të skedarit; nuk është verifikuar në mënyrë të pavarur. Shiriti i shkallës: nuk është i disponueshëm; nuk jepet kalibrim. Fotografi nga Alvy16, 2019, nga Qelizë qepe 200x, me licencë CC BY 4.0.
Ndarjet e zgjatura formojnë një shtresë të organizuar. Krahasoni kufijtë e tyre të gjatë të përbashkët me konturet e parregullta në Figurën 1. Vëreni gjithashtu materialin e errët të spikatur dhe ndriçimin jo të njëtrajtshëm të fushës. Fotografia nuk përcakton identitetin e çdo depozitimi të errët. Ajo tregon pse një dokumentim i dobishëm i vëzhgimit përfshin artefaktet dhe pasigurinë, në vend që të etiketojë gjithçka që merr ngjyrë.
Figura 3: maja të identifikuara nga burimi si Candida spp.
Mostra: Candida spp., sipas fotografes. Ngjyruesi: ngjyrosje e thjeshtë pozitive me blu metileni. Zmadhimi: nuk është i disponueshëm. Shiriti i shkallës: nuk është i disponueshëm; nuk jepet madhësi e kalibruar e pikselit. Fotografi nga Marta, përdoruesja e Wikimedia Martunia.g, 2021, nga Ngjyrosje pozitive me blu metileni 2, me licencë CC BY 4.0.
Krahasoni grumbullimet e dendura blu me skajet më pak të ngjeshura. Konturet individuale ndiqen më lehtë aty ku objektet mbivendosen më pak. Emri Candida vjen nga dokumentimi i burimit, jo nga një identifikim i species i kryer mbi këtë fotografi. Kjo figurë nuk jep as rezultat për gjallërinë e qelizave. Provat e gjallërisë dhe frymëmarrjes së majave kërkojnë kushtet, kontrollet dhe interpretimin e tyre.
Interpretimi i saktë i shkallës
Këto figura mundësojnë krahasim pamor, jo matje në mikrometra ose krahasime të madhësisë absolute të qelizave midis figurave. Zmadhimi i raportuar nuk e zëvendëson kalibrimin e munguar të kamerës. Ndryshimi i madhësisë së shfaqjes së një imazhi ndryshon zmadhimin e tij të dukshëm.
Për imazhet tuaja, kryeni një kalibrim matjeje duke përdorur një standard të njohur dhe konfigurimin përkatës optik. Udhëzuesi i Nikon për mikrometrinë shpjegon se si një mikrometër i tavolinës së mikroskopit i shndërron ndarjet arbitrare të imazhit ose të rrjetës matëse në gjatësi fizike. Shënoni objektivin, konfigurimin e kamerës dhe kalibrimin, dhe shtoni një shirit shkalle nga këto të dhëna. Mos e nxirrni shkallën e shiritit nga madhësia mesatare e qelizave e dhënë në një tekst mësimor.
A përputhet shishja me metodën?
Një shishe e etiketuar si blu metileni nuk përbën një specifikim të plotë laboratorik. Kontrolloni përqendrimin dhe njësitë, tretësin, përbërësit shtesë, përdorimin e synuar, dokumentacionin e serisë dhe udhëzimet. Fleta e të dhënave të sigurisë së një reagjenti përshkruan rreziqet; udhëzimet e metodës përcaktojnë si duhet përdorur ai për preparatin e synuar.
Një shembull konkret është tretësira e blusë së metilenit sipas Löffler nga Merck. Prodhuesi e identifikon si reagjent për mikroskopi dhe përshkruan rolin e saj si kundërngjyrues në ngjyrosjen acido-rezistente. Ndezshmëria e saj e deklaruar tregon gjithashtu pse “një lëng blu” është informacion i pamjaftueshëm për të planifikuar trajtimin ose ngrohjen. Këto veti i përkasin atij formulimi, jo automatikisht çdo tretësire ujore të blusë së metilenit.
Po kështu, agari me eozinë dhe blu metileni është një mjedis kulture i formuluar. Ai nuk është një ngjyrues për lama i përgatitur duke shtuar thjesht blu metileni në një mostër. Për një qëllim tjetër imazherie, krahasoni alternativat e blusë së metilenit për mikroskopi.
Për një komplet mikroskopi për fillestarë, nisni me metodën e tij mësimore të dokumentuar, me lama të përgatitura me përmbajtje të njohur dhe me reagjentin e përcaktuar. Nëse një shishe e ka humbur etiketën ose përbërja e saj nuk mund të përcaktohet, zëvendësojeni me reagjentin e përshtatshëm të dokumentuar. Përdorni mbrojtje për sytë dhe ndiqni udhëzimet e trajtimit të dhëna për formulimin konkret. Materiali njerëzor dhe mostrat e panjohura nga mjedisi kërkojnë procedurat e laboratorit mësimor për trajtimin dhe asgjësimin e mostrave; ngjyrosja nuk i zëvendëson këto procedura.
Shkruani vëzhgimin përpara përfundimit
“Objekte ovale blu të grumbulluara” është një përshkrim i mbështetshëm i një imazhi. “Një infeksion i caktuar” kërkon prova që imazhi nuk i ka dhënë. Në fletoren e laboratorit, mbajini të ndara prejardhjen e mostrës, përgatitjen, reaksionin e ngjyrosjes dhe metodën e identifikimit. Ky dallim e bën të dobishëm një imazh të thjeshtë mësimor dhe pengon që një mikrofotografi tërheqëse të mbartë një pretendim që nuk mund ta mbështesë.