Poskusi, ki so metilensko modrilo povezali s celičnim dihanjem

Defibrinirana človeška kri, tri ure segrevana pri 37 °C, porabi približno dva odstotka kisika, ki ga vsebuje. Če pred inkubacijo dodamo majhno količino metilenskega modrila, ista kri porabi približno petinšestdeset odstotkov. Na celicah se ni nič spremenilo. Spremenila se je le raztopina.

Ta številka izhaja iz članka, ki sta ga leta 1928 na univerzi Johns Hopkins objavila George Harrop in E. S. Guzman Barron, in je izvor pogosto ponavljane trditve, da metilensko modrilo izboljšuje celično dihanje. Trditev ni napačna, vendar je njen pomen ožji, kot se zdi.

Kaj številka v tabeli dejansko meri

Merjeni izid je bil privzem kisika, določen s plinsko analizo. Harrop in Barron sta sveže odvzeto kri pri 10 °C filtrirala skozi vato, da bi odstranila bele krvničke, vzorec nasičila s kisikom, ga razdelila, enemu delu dodala barvilo in po inkubaciji analizirala oba dela. Število levkocitov je redko preseglo približno tisoč na kubični milimeter. Porabo kisika sta prikazala kot delež začetne vsebnosti kisika v vzorcu, ki je izginil.

Merila sta tudi ogljikov dioksid, vendar jima je pri tem metoda povzročala težave. Defibrinirana kri je v prvi uri inkubacije sprostila do dva milimola ogljikovega dioksida na 100 mL iz razlogov, ki niso bili povezani s preučevano reakcijo, zato respiracijski količniki iz polne krvi niso bili uporabni. Le oprane celice v Lockovi raztopini so dale vrednosti, ki jih je bilo mogoče interpretirati; te so se z barvilom in brez njega gibale med 0.73 in 0.80.

Ta podrobnost ni nepomembna. »Dihanje« v teh člankih pomeni izmenjavo plinov v zaprti posodi. Razkorak med porabo kisika in nastajanjem uporabne energije je posebej obravnavan v članku kaj vam poraba kisika pove o ATP in česa ne.

Barvilo je največ prispevalo tam, kjer so celice najmanj dihale

Zreli eritrociti sesalcev skoraj nimajo merljive porabe kisika. Ptičji eritrociti z jedrom jo imajo. Harrop in Barron sta preizkusila oboje, ta razlika pa je temelj njune razlage.

V vzorcih sesalcev je barvilo povzročilo dvajset- do petdesetkratno povečanje. V gosji krvi, katere celice so že dihale, hitrosti ni nikoli povečalo za več kot dvakrat. Višja kot je bila začetna stopnja dihanja, manj je lahko dodalo barvilo.

Enak vzorec se pojavi znotraj ene vrste. Vzorec človeške krvi bolnika s pravo policitemijo, ki je vseboval nezrele celice, je brez barvila porabil 11.3 odstotka svojega kisika, oprane celice zdravega darovalca pa 2.8 odstotka. Barvilo je porabo povečalo le na 63.4 odstotka, kar je pomenilo šestkratno pospešitev, medtem ko so se normalne celice pospešile skoraj tridesetkrat. Barvilo je zrele celice približalo vedenju nezrelih, kar sta avtorja tudi navedla kot njegovo delovanje.

Cianid bi moral učinek ustaviti

Znano je bilo, da cianid ustavi celično oksidacijo. Harrop in Barron sta ga kljub temu dodala skupaj z barvilom.

Rezultati z govejo krvjo so značilni. Brez dodatkov je vsebnost kisika v treh urah padla z 22.61 na 22.03 volumenskega odstotka. Z metilenskim modrilom je padla na 12.84. Z metilenskim modrilom in kalijevim cianidom v koncentraciji ene pettisočinke mola na liter je padla na 12.74. Učinek barvila je ostal skoraj nespremenjen.

Slika: neprekinjen zapis mikrorespiracije človeških eritrocitov. Puščica označuje dodatek metilenskega modrila. Pred tem je krivulja skoraj ravna, nato pa enakomerno narašča. Povzeto po Harropu in Barronu, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Sklenila sta, da barvilo deluje kot prenašalec kisika, ki »zagotavlja snov, ki je izginila iz zrelih eritrocitov sesalcev brez jedra«. Dve leti pozneje sta Michaelis in Salomon na Rockefellerjevem inštitutu nesoglasje ubesedila v obliki, ki ostaja veljavna. Bodisi je bil učinek barvila »naključna lastnost barvila« bodisi je bilo barvilo »model za neko neznano snov v organizmih«. Ta dilema še ni razrešena. Spremenilo pa se je to, da lahko celice zdaj opišemo veliko natančneje.

Jetrni izvleček je povzročil enak učinek

Michaelis in Salomon sta pokazala, da izvlečki organov, pripravljeni s hladno vodo, povzročijo enako stimulacijo. Najmočnejši učinek so imela podganja jetra, sledili so ledvica, vranica in modo. Možgani, mišice in krvni serum so imeli majhen učinek ali pa ga sploh niso imeli.

Nato sta izvleček preizkusila v prisotnosti ogljikovega monoksida. Dihanje, ki ga je povzročil bodisi izvleček bodisi barvilo, je ostalo nespremenjeno v mešanici 98 odstotkov ogljikovega monoksida in 2 odstotkov kisika. Ista plinska mešanica je zavrla dihanje kvasovk in ptičjih eritrocitov z jedrom za približno 60 do 80 odstotkov, skladno z Warburgovim opisom dihalnega encima, občutljivega na ogljikov monoksid. Neidentificirana tkivna snov torej ni bila Warburgov encim.

Med raziskovanjem sta izločila več možnih snovi. Reducirani glutation in cistein sta povzročila le porabo kisika, potrebno za njuno lastno oksidacijo. Hardenov in Youngov koencim sta izključila, ker ga mišice vsebujejo največ, pokazale pa so skoraj najmanjši učinek. Keilinov citokrom, poimenovan nekaj let prej, je naletel na isto protislovje. Svojo domnevo, da aktivna snov izvira iz celičnega jedra, sta označila zgolj za domnevo.

Učinek je bil vezan na določene pogoje

Celice so morale biti nepoškodovane. Hemoliza z destilirano vodo ali večkratnim zamrzovanjem je odpravila odziv tako na barvilo kot na izvleček, delna hemoliza pa ga je sorazmerno zmanjšala.

Potreben je bil tudi sladkor. Glukoza, fruktoza in saharoza so omogočale dihanje, ki ga je sprožilo barvilo; manitol ga ni. Brez sladkorja dihanja sploh ni bilo, zdelo pa se je, da barvilo pri tem poškoduje celice, zato glukoza, dodana eno ali dve uri pozneje, dihanja ni obnovila. Avtorja sta domnevala, da barvilo oksidira strukturno sestavino, ki jo celica potrebuje.

Osvetlitev je učinek barvila precej povečala, čeprav je bil učinek jasen tudi v temi. Druga barvila, ki jih je mogoče reducirati, so se vedla drugače: toluilensko modrilo je doseglo ali preseglo učinek metilenskega modrila, indigo disulfonat pa ni povzročil skoraj ničesar. Jasna povezava med oksidacijsko-redukcijskim potencialom barvila in velikostjo njegovega učinka se ni pokazala, kar sta avtorja pripisala prepustnosti membrane in toksičnosti.

Učinek je sledil fermentaciji, ne dihanju

Barronova raziskava iz leta 1930 je prešla s celičnih suspenzij na tkivne rezine normalnih podganjih organov in presajenih tumorjev.

V tkivih brez aerobne glikolize metilensko modrilo ni povzročilo ničesar ali pa je rahlo zmanjšalo porabo kisika: v ledvicah za približno 14 odstotkov, v trebušni slinavki za približno 14 odstotkov in v jetrih za približno 5 odstotkov. V tkivih, ki fermentirajo v prisotnosti kisika, je porabo povečalo: v vranici za približno 8 odstotkov in v možganih za približno 13 odstotkov. Povečanja pri tumorjih so segala od približno 27 odstotkov pri človeškem karcinomu dojke do več kot 80 odstotkov pri Rousovem sarkomu kokoši, približno sorazmerno z aerobno glikolizo posameznega tkiva.

Slika: vsaka točka predstavlja eno vrsto tkiva. Vodoravna os prikazuje aerobno glikolizo, navpična pa spremembo porabe kisika po dodatku metilenskega modrila. Podatki iz Barrona, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), tabela 6, PMID 19869777.

Poskus s cianidom je nato dal zrcalno sliko. Ko so dihanje v teh prej neodzivnih tkivih blokirali s cianidom in je fermentacija stopila v ospredje, je barvilo znova povečalo porabo kisika: v ledvicah za približno 59 odstotkov, v jetrih za približno 19 odstotkov, v vranici za približno 286 odstotkov in v modu za približno 200 odstotkov.

Barron je predlagal, da bi lahko barvilo služilo kot preizkus fermentacijske zmogljivosti celice ali tkiva, in zaključil z domnevo: več generacij gojenja tumorja v gojišču z barvilom bi morda nekoč lahko trajno spremenilo presnovo tumorja v takšno, kot jo ima normalno tkivo. To je bilo raziskovalno vprašanje, zapisano leta 1930. Ni trditev o zdravljenju.

Česa ti poskusi niso mogli meriti

V letih 1928 in 1930 je »dihanje« pomenilo porabo kisika. O adenozin trifosfatu so prvič poročali leta 1929, dokaz, da izolirani mitohondriji med prenosom elektronov esterificirajo fosfat, pa je sledil leta 1949. Noben od zgodnjih člankov o metilenskem modrilu ni mogel meriti nastajanja energije in noben tega tudi ni trdil.

Druga težava so celice. Zreli eritrociti sesalcev ne vsebujejo mitohondrijev. V retikulocitni fazi s selektivno avtofagijo odstranijo mitohondrije in ribosome, zato zrela rdeča krvnička energijo pridobiva z glikolizo, od pentoznofosfatne poti pa je odvisna predvsem zaradi NADPH, ne ATP. V poskusih iz leta 1928 ni bilo prisotne nobene verige prenosa elektronov, ki bi jo bilo mogoče popraviti. Kar koli je porabljalo kisik, je počelo nekaj drugega.

Kaj je bilo to nekaj drugega, je zdaj razmeroma dobro opisano. Metilensko modrilo sprejema elektrone iz celičnih redukcijskih ekvivalentov in postane levkometilensko modrilo, ki ga molekularni kisik znova oksidira in tako sklene cikel. V človeških rdečih krvničkah korak redukcije izvajajo od NADPH odvisna flavin reduktaza in sorodne disulfid reduktaze. Raziskava iz leta 1976 z označeno glukozo je pokazala, da barvilo spodbuja heksozamonofosfatno pot, da je učinek pri nizki koncentraciji odvisen od oksihemoglobina in da višja koncentracija, 0.1 mM, povzroči nastajanje vodikovega peroksida. Reducirano barvilo ob stiku s kisikom tvori peroksid, ne fosfatnih vezi.

V mitohondrijih je slika bolj sporna, kot priznavajo poljudni povzetki. Ena smer raziskav zagovarja, da barvilo prevzame elektrone na območju kompleksa I in jih preda citokromu c. Druga je ugotovila, da v mitohondrijih mišjih možganov ne more obnoviti dihanja po blokadi z antimicinom, mesto sprejemanja elektronov pa je namesto tega umestila na vezavno mesto za ubikinol v kompleksu III. Tretja je ugotovila, da nizke koncentracije povečajo porabo kisika v mirovanju, dihanje, spodbujeno z ADP, pa ostane nespremenjeno. Najbolj neposredna ugotovitev je, da poraba kisika, ki jo povzroči metilensko modrilo, sploh ni odvisna od oksidativne fosforilacije: vztrajala je tudi ob zavrti dihalni verigi in v pripravkih, ki je niso vsebovali.

Obstajajo tudi neposredne meritve razkoraka med obema količinama. V izoliranih mitohondrijih podganjih jeter so naraščajoče koncentracije barvila zniževale razmerja respiracijskega nadzora in povzročale nabrekanje, kar so avtorji opisali kot razklop oksidativne fosforilacije. V perfundiranih podganjih jetrih je metilensko modrilo povečalo porabo kisika, medtem ko se je razmerje med ATP in ADP zmanjšalo.

Klinični podatki prinašajo enako sporočilo. Methemoglobinemijo zdravijo z intravenskim dajanjem približno enega do dveh miligramov metilenskega modrila na kilogram, prek od NADPH odvisne redukcijske poti, večji odmerki pa povzročijo stanje, ki ga zdravijo. Isti pregled navaja, da je učinek protistrupa največji v nepoškodovanih eritrocitih in zmanjšan ob prisotni hemolizi, kar pomeni, da se ugotovitev o hemolizi iz leta 1930 triinsedemdeset let pozneje znova pojavi v bolnišničnem okolju. Pri spojini, katere koristni in škodljivi učinki so na nasprotnih straneh odmernega praga, odmerka ne bi smeli določati na podlagi meritve porabe kisika.

Zakaj v razpravo sodi tudi serija

Harrop in Barron sta opazila nekaj, kar je vredno ponovno prebrati. Metilensko modrilo samo v spektroskopu ustvari pas med značilnima pasovoma methemoglobina, »kar lahko pri površnem pregledu zlahka povzroči zmedo«. Barvilo lahko posnema snov, ki jo iščemo.

Ista težava ima tudi kemijsko obliko. Sorodni fenotiazin, prisoten kot manjša sestavina, ima svoje redoksno vedenje, svojo prepustnost in svojo toksičnost. En dokumentiran primer pokaže, kaj to pomeni v praksi: v raziskavi jodiranja metilenskega modrila so vzorci, ki so vsebovali približno 7 do 8 odstotkov Azure B, tvorili predvsem jodirani Azure B, zato je v reakciji prevladovala nečistota, ne metilensko modrilo.

Kdor uporablja metilensko modrilo kot reagent, v laboratoriju, pri barvanju preparatov ali v akvariju, dela s sestavino neopredeljene sestave, če serija ni bila karakterizirana. Sorodne snovi, identiteta, elementarne nečistote, ostanki topil in ostanek po žarenju so del poskusa, ne zgolj spremljajoča dokumentacija. Blupreme pridobiva metilensko modrilo od farmacevtskega proizvajalca in objavlja celoten certifikat analize, pri čemer preverja celotno specifikacijo USP, ne le težkih kovin; vodnik za branje certifikata analize in članek kaj oznaka kakovosti USP potrjuje in česa ne pojasnjujeta, kako preveriti, ali dokument podpira navedeno trditev.

Številka je bila pravilna

Poskusi iz let 1928 in 1930 so bili skrbno izvedeni in njihova osrednja ugotovitev se je ohranila: barvilo, ki ga je mogoče reducirati, lahko povzroči, da celica, ki skoraj ne diha, porablja kisik z mnogokratnikom hitrosti v mirovanju, ne da bi pri tem prešla skozi korak, ki ga blokira cianid.

Napaka se pojavi pozneje, ko »dihanje« razumemo v sodobnem pomenu. Meritev izmenjave plinov pove, da so elektroni prispeli do kisika. Ne pove pa, ali je bil kateri od njih uporabljen za tvorbo ATP, in v celici brez mitohondrijev je razkorak med tema trditvama največji možen. Širši pregled delovanja metilenskega modrila v celicah postavlja isto razlikovanje v širši okvir, zgodovina spojine od barvila do zdravila pa pojasnjuje, kako je tekstilno barvilo sploh prišlo do teh poskusov.